白梨和砂梨S基因型确定及S34新基因的分离

梨是配子体型自交不亲和植物, 确定不同品种的S基因型是科学杂交授粉及提高梨产量和品质的基础。本文根据砂梨S1-9等位基因一级结构特征, 设计特异引物PF和PR, 以白梨(Pyrus bretschneideri)品种鹅梨(Pyrus bretschneideri ‘El i’) 和砂梨(Pyrus pyrifolia)品种博多青(Pyrus pyri folia ‘Hakataao’) 的叶片基因组DNA为模板, 通过 PCR-RFLP系统检测、克隆测 序以及生物信息学分析, 分离鉴定了它们的片段大小相似的2条S等位基因, 从中获得1条新的S基因, 命名为S34-RNase基因, 并确定了这2个梨品种的S基因型, 分别为鹅梨S13S34和博多青S22S34。     

中国梨2个自交不亲和新等位基因(S等位基因)的分子鉴定

自交不亲和是显花植物的一种重要生殖生理现象,为探明中国梨的自交不亲和特性,对‘锦香’(Pyrus bretschneideri cv. Jinxiang)和‘鹅酥’(Pyrus bretschneideri cv. Esu)2个中国梨品种进行了基因组PCR特异扩增、S基因序列分析及田间杂交授粉试验。结果确定它们各含1个新S-RNA酶基因,分别命名为S37-和S38-RNase,GenBank序列号为DQ839238和DQ839239。生物信息学分析结果表明,S37-和S38-RNA酶的推导氨基酸序列与S1-至S36-RNA酶36个梨S基因具有相同的、高度保守的C1和C2区,但其高变区与S1-至S36-RNA酶差异较大,其中与S15的差异最小,只有3个氨基酸不同。在推导的氨基酸水平上,S37与S38有96%的序列相似性,但两者与S15的相似性更高,皆为98%,与S32的相似性最低,都只有63%;S37和S38的内含子较大,分别为786bp和723bp,与S15的777bp大小接近。最后,经分析验证确定‘锦香’和‘鹅酥’的S基因型分别为S34S37和S15S38。     

中国梨品种S基因型鉴定的初步研究

采用PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳法对6个中国梨品种的s基因型进行了鉴定研究,并与已知S基因型的日本梨品种进行了比较。研究结果表明,供试的6个中国梨品种S基因型均不相同,‘西子绿’、‘金花’和‘金水酥’各包含了S1～S7以外的新的S基因,为这些品种田间授粉品种的选配提供了参考。     

基于cDNA芯片的梨品种S基因型鉴定及新S-RNase基因进化分析

梨品种S基因型鉴定对梨栽培中授粉品种选择和遗传育种都具有重要意义。本研究利用梨S-RNase基因荧光标记的特异引物PCR扩增获得梨品种荧光标记的cDNA特异产物;进一步完善梨S-RNase基因cDNA芯片,以被检测梨品种cDNA特异序列与梨S-RNase基因cDNA芯片杂交检测不同梨品种S基因型,并发现新的S-RNase基因。结果表明:利用梨S-RNase基因cDNA芯片鉴定了泸定王皮梨、兴山24号、弥渡百合等35个未知S基因型梨品种,确定了各品种的S基因型。结合PCRRFLP及DNA克隆和测序等技术,发现了7个新的S-RNase基因资源,获得了新S-RNase基因序列。序列分析表明各新S-RNase基因均具有S-RNase基因特异区域序列的典型特征;进化分析显示7个新S-RNase基因主要属于蔷薇科苹果亚科S-RNase类群,且存在种间和属间比种内和属内进化关系更近的现象。7个新的S基因分别命名为:PpS_(53)(Pyrus pyrifolia S53)、PpS_(54)、PpS_(55)、PpS_(56)、PpS_(57)、PpS_(58)和PpS_(59),GenBank登录号分别为:KX581753、KX581754、KX581755、KX581756、KX581757、KX581751和KX581752。     

高温胁迫对‘黄冠’、‘翠玉’梨耐热生理指标及相关基因表达的影响

为探讨高温胁迫对梨树的影响,对2年生‘黄冠’(Pyrus pyrifolia‘Cuiguan’)、‘翠玉’(P.bretschneideri×P.pyrifolia)盆栽苗胁迫后叶片的抗氧化物质、抗氧化酶、渗透物质和激素的变化进行了测定,利用q RT-PCR分析了叶片中抗性基因的表达。结果表明,在高温胁迫下,梨树叶片的叶绿素含量明显下降,而MDA含量则持续上升;梨叶片中的POD和CAT活性总体呈下降趋势,但‘黄冠’的POD和CAT活性均高于‘翠玉’;PRO含量随胁迫时间延长逐渐增加;ASA含量表现出先上升后下降,且‘黄冠’的ASA含量高于‘翠玉’;IAA和ABA含量都随胁迫时间的延长呈下降趋势,但‘黄冠’的IAA和ABA含量比‘翠玉’高。q RT-PCR结果表明,叶片中相关基因的表达量与对应的ASA、IAA和ABA含量变化趋势基本一致。因此,‘黄冠’比‘翠玉’抗高温性能强,且高温处理第4天为‘黄冠’和‘翠玉’梨的生理变化转折点。     

基于苹果EST-SSR的梨种质资源遗传多样性分析

利用来自苹果的8对EST-SSR标记对48份梨(Pyrus)种质资源进行遗传多样性研究,以分析其在梨属植物上的通用性.结果表明,8对EST-SSR引物在供试材料上均能扩增出与苹果大小相似的产物,所有引物共检测到140个基因位点,其中多态性位点129个,多态性比例为92.14%,并且可成功区分不同品种.根据EST-SSR标记所揭示的多态性和UP-GMA法聚类分析,48份梨种质资源在相似系数0.62处可分为东方梨和西方梨两个种群,而中国的白梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)、砂梨(P.pyrifolia Burm.f.Nakai)和秋子梨(P.ussuriensis Maxim.)相互交错在一起,没有独自成组.可见,苹果的EST-SSR标记在梨上具有高度的可转移性,可应用于梨属植物的资源评价及遗传关系研究.     

‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω 羟基棕榈酸O 阿魏酰转移酶（ω hydroxypalmitate O feruloyl transferase, HHT）基因cDNA的全长,命名为 PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335 bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT PCR）表达分析显示,2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6~9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。     

不同栽培区域和年份的红皮砂梨果皮着色特性

该研究以红皮砂梨品种‘八月红’和‘红香酥’为试材,比较了不同栽培地区和年份的红皮砂梨着色规律、花色素苷组分及含量,以及相关代谢酶的变化。结果显示:（1）‘八月红’和‘红香酥’果皮花色素苷含量变化规律由其品种特性决定,同一品种的果皮花色素苷绝对含量受不同栽培区域和年份的影响,其组成和含量变化趋势不受影响;但不同品种的花色素苷含量变化以及着色规律有所不同。（2）红色砂梨果皮着色主要与矢车菊-3-半乳糖苷含量变化一致,且随着梨果实的发育和着色加深,果实中UDP-葡萄糖:类黄酮-3-O葡萄糖苷转移酶（UFGT）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）活性呈上升趋势,而苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性随着果实发育而下降。（3）相关性分析表明,两品种梨果实花色苷含量与其UFGT、DFR活性呈显著或极显著正相关关系,而与PAL活性相关性不一致。研究表明,梨果皮中的UFGT、DFR是影响红皮砂梨着色的重要酶。     

不同低温需求量砂梨休眠相关基因PpMADS13的特征及表达模式

为探究福建主栽的不同低温需求量砂梨Pyrus pyrifolia品种中休眠相关基因PpMADS13-1和PpMADS13-3序列及表达特征,以‘黄花’、‘蜜雪’两品种休眠时期的花芽为材料,克隆PpMADS13-1和PpMADS13-3基因,利用荧光定量PCR技术分析基因在休眠时期的表达变化情况。结果显示,PpMADS13-1序列在砂梨两品种间较保守,而PpMADS13-3序列在两品种间保守性较差;‘黄花’梨PpMADS13-1hh和PpMADS13-3hh在休眠期间随着休眠的解除下调表达,‘蜜雪’梨PpMADS13-1mx和PpMADS13-3mx在休眠期间呈现“M”型表达趋势。PpMADS13-1和PpMADS13-3均对砂梨的花芽休眠解除起到调控作用,在不同低温需求量品种间PpMADS13-1和PpMADS13-3的休眠调控模式有所不同。     

24个菊芋品种（系）遗传多样性的ISSR标记分析

利用ISSR分子标记技术研究了来源于国内外不同区域的24个菊芋（Helianthus tuberosus Linn．）品种（系）的遗传多样性,并结合块茎特征采用聚类分析法探讨了它们的遗传关系。结果表明：用16条ISSR引物从24个品种（系）的基因组DNA共扩增出242条带,包含228条多态性条带,多态性条带百分率达94．2％,其中7条引物的多态性条带百分率达100．0％。各品种（系）间的遗传距离为0．19～1．01,遗传距离平均值为0．45。聚类分析结果显示：在遗传相似系数0．68处可将24个品种（系）划分为5类,第1类仅包含‘青芋1号’（‘Qingyu No．1’）,第Ⅱ类仅包含W12,第Ⅲ类包含W30、W42、‘青芋2号’（‘Qingyu No．2’）、W09、W18、W26和WSl,第Ⅳ类包含W06和W84,第V类包含‘青芋3号’（‘Qingyu No．3’）、w23、W36、W43、W54、W75、WS0、W62、W64、W79、S150、S138和W66;多数块茎特征相似的品种（系）被聚在一起,但也有部分块茎特征不同的品种（系）被聚在同一类中;部分品种（系）的聚类分析结果与其形态分类结果及地理分布不一致。研究结果表明：供试的菊芋品种（系）具有较高的遗传多样性,存在着较为频繁的基因交流;基于ISSR标记分析能较准确地揭示出菊芋品种（系）间的遗传多样性。     

梨种质资源对黑星病抗性评价

采用人工接种黑星病菌的方法,对国家果树种质兴城梨资源圃保存的197份梨种质资源进行了抗病性鉴定,结果表明:不同梨种类发病率差异很大,其中白梨和砂梨最易感病,秋子梨和种间杂交选育品种较易感病,新疆梨较抗病,西洋梨最抗病;对病情指数在各梨种类分布进行了分析;在白梨、砂梨、秋子等各系统分别筛选出黄鸡腿、甩梨、酸梨、锦香等一批抗病资源;对田间自然感病与人工接种感病结果进行了比较。     

Rapid identification of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) synthase genotypes in cultivars of Japanese pear (Pyrus pyrifolia Nakai) using CAPS markers

In Japanese pear (Pyrus pyrifolia Nakai), fruit storage potential is closely related to the amount of ethylene produced. We have developed a rapid and accurate method for analyzing genes involved in high ethylene production during fruit ripening in Japanese pear. This involves cleaved-amplified polymorphic sequences (CAPS) of two 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) synthase genes (PPACS1 and PPACS2). Two CAPS markers (A for PPACS1 and B for PPACS2), associated with the amount of ethylene produced, were identified. Marker A was associated with high ethylene producers and marker B with moderate ethylene producers. The absence of these two markers enabled the identification of low ethylene producers. Using these markers, we have identified ethylene genotypes for 40 Japanese pear cultivars and two Chinese pear (P. bretschneideri) cultivars that are commercially important and used in breeding programs. Furthermore, we performed linkage analysis of these two genes in the F(2) population, which revealed that the recombination frequency between the two markers was 20.8 +/- 3.6%. This information is critical to the selection of parents and in breeding strategies to improve storage ability of Japanese pears.     

云南红梨PyMT基因的克隆、原核表达和功能分析

金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一种在生物中普遍存在的多功能蛋白.根据云红梨1号光特异性差减文库中获得的PyMT(Pyrus pyrifolia metallothionein)基因序列,PCR扩增4种红梨PyMT的基因组序列并进行序列分析;通过RT-PCR方法从云红梨1号果皮中扩增出PyMT基因,并将其命名为PyMT1(Pyrus pyrifo-lia metallothionein 1).构建原核表达载体pGEX-4T-1-PyMT1,在E.coli BL21中进行表达;通过在液体培养基中添加不同浓度的重金属离子,检测转化菌和对照菌的的生长曲线,分析PyMT1的功能.序列分析表明,PyMT1是典型的Metallothion 2.PyMT1氨基酸序列系统发育分析表明,PyMT1与MdMT亲缘关系最近.SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期的大小一致;生长曲线结果表明工程菌对重金属离子Zn、Cu、Cd具有一定的耐受性.这些结果为进一步纯化、鉴定目的蛋白和研究其结构和功能奠定了基础.     

基于苹果基因组开发梨的多态性SSR引物

从NCBI网站获取‘金冠’苹果基因组数据,在每条染色体上随机设计4对共68对引物。利用梨品种‘黄冠’和‘莱阳茌梨’及其F1代杂交群体(共94个单株)对这些引物的应用性进行验证,同时分析了该群体遗传多样性。(1)引物扩增结果显示,有40对引物可以扩增出预期目的条带,占设计引物数量的58.82%,其中16对引物能够扩增出多态性条带。(2)群体遗传多样性分析结果显示,有16对多态性引物扩增产物的等位基因数平均为2.312 5,有效等位基因数平均为2.001 4,平均杂合度观测值、期望杂合度和香农指数分别为0.548 3、0.490 5和0.746 2,表明可以在梨上运用。研究证明,SSR位点在苹果与梨之间可以转移应用。     

Comparative analysis of chloroplast DNA in Pyrus species: physical map and gene localization

A physical map of chloroplast DNA (cpDNA) of pear [Pyrus ussuriensis var. hondoensis (Nakai et Kikuchi) Rehder] was constructed using five restriction enzymes, SalI, XhoI, BamHI, SacI and PstI. This information will make it possible to investigate the phylogenetic relationships between Pyrus species. Pear cpDNA was found to be a circular molecule with a total size of about 156 kb in which two inverted repeats of 24.8 kb divide the molecule into small (17 kb) and large (90 kb) single-copy regions. The endonuclease recognition sites in the physical map were determined by single and double digestion of 13 lambda phage clones which covered the entire sequence of the pear cpDNA. Twenty nine genes were localized on the physical map of the pear cpDNA. The structure of pear cpDNA was almost the same in terms of genome size and gene order as that of tobacco cpDNA. RFLP analysis was carried out on cpDNAs from five Pyrus species (Pyrus pyrifolia, Pyrus ussuriensis, Pyrus calleryana, Pyrus elaeagrifolia and Pyrus communis). Two mutations, a recognition-site mutation and a length mutation (deletion), were found only in the cpDNA of P. pyrifolia cultivars. These mutations were localized on the physical map of pear cpDNA. The number of mutations of cpDNA in Pyrus species are small in comparison with those of other angiosperms, suggesting a high degree of genome conservatism in Pyrus species.     

不同基因型梨木质素代谢对石细胞含量和果实口感的影响

以五种基因型梨果实为材料,对石细胞团的大小、分布进行解剖学观察,并测定石细胞、木质素含量和木质素相关合成酶PAL、POD、PPO活性,探讨不同基因型梨果实木质素代谢对石细胞含量及口感的影响.结果表明,不同基因型梨木质素含量高时,石细胞含量也高,石细胞团相对较大,分布较密集,口感差.各基因型的梨木质素、石细胞含量和大小为...     

沙梨8个栽培品种的DNA指纹鉴定

利用RAPD标记技术,对8个沙梨(Pyrus pyrifolia)主栽品种进行RAPD分析。结果显示,从33个10碱基随机引物中筛选出了2个多态性高的引物S2075和S1296,扩增位点分别为11个和10个,以此为基础建立了8个品种的DNA指纹图谱;根据这2个引物中任何一个的扩增图谱均可以将这8个品种区分。研究结果为沙梨品种的区别与鉴定提供了一种有效方法。