硫化氢通过调控SIRT1抑制阿霉素诱导的H9c2细胞损伤

目的探讨硫化氢（H₂S）对阿霉素（DOX）诱导的H9c2细胞损伤的影响及其作用机制。 方法H₂S对DOX心肌毒性保护作用的实验分组为：对照组（Control组）,5?μmol/?L DOX处理组（A组）,5?μmol/L DOX和400?μmol/L NaHS共同处理组（B组）,400?μmol/L NaHS单独处理组（C组）,5?μmol/L DOX、400?μmol/L NaHS和15?μmol/L Sirtinol共同处理组（D组）,15?μmol/L Sirtinol单独处理组（E组）。SIRT1是否参与H₂S抗DOX心肌毒性作用机制的实验分组为：对照组（Control组）,5?μmol/L DOX处理组（F组）,5?μmol/L DOX和400?μmol/L NaHS共同处理组（G组）,5?μmol/L DOX、400?μmol/L NaHS和15?μmol/L Sirtinol共同处理组（H组）,15?μmol/L Sirtinol单独处理组（I组）。使用MTT法检测细胞活力;Elisa法检测细胞MDA以及SOD水平;DCFH-?DA荧光探针法检测ROS水平;采用Western Blot法检测SIRT1蛋白表达。使用单因素方差分析法进行统计学分析。 结果NaHS预处理可抑制DOX导致的H9c2细胞活力下降：Control组,A组、B组、C组细胞活力分别为100﹪、（54.58±1.58）﹪、（85.05±4.31）﹪、（100.22±4.46）﹪ （F = 134.9,P < 0.001）。NaHS预处理可减弱DOX引起的H9c2细胞ROS、MDA水平的增加以及SOD水平的降低：Control组的ROS、MDA和SOD水平分别是100﹪、（34.18±1.56） μmol/g、（53.69±1.44） U/?mg;A组的ROS、MDA和SOD水平分别是（174.90±12.65）﹪、（72.65±2.66） μmol/g、（31.80±2.05） U/?mg;B组的ROS、MDA和SOD水平分别是（126.08±6.25）﹪、（44.59±1.92） μmol/g、（48.06±1.56） U/mg;C组的ROS、MDA和SOD水平分别是（91.86±1.66）﹪、（32.93±1.56）?μmol/?g、（55.93±1.58）?U/?mg （F?= 83.26,P < 0.001;F = 271.4,P < 0.001;F = 127.0,P < 0.001）。F组（6、12、24?h）H9c2细胞SIRT1蛋白表达水平分别是（0.45±0.03）、（0.27±0.02）、（0.25±0.03）,较Control组（1.00±0.00）降低（F = 611.1,P < 0.001）。本研究还发现,NaHS预处理H9c2细胞能阻止DOX引起的SIRT1蛋白表达下调：Control组、F组、G组、H组的SIRT1蛋白表达水平分别是（1.00±0.00）、（0.31±0.03）、（0.60±0.04）、（1.09±0.09）（F = 123.4,P?2S对DOX诱导的H9c2细胞活力降低的抑制作用：Control组,F组、G组、H组、I组细胞活力分别为100﹪、（54.58±1.58）﹪、（85.37±3.62）﹪、（71.11±2.11）﹪、（97.53±1.45）﹪ （F = 238.2,P < 0.001）。Sirtinol预处理可明显逆转H₂S对DOX导致的H9c2细胞ROS和MDA含量增加及SOD水平降低的抑制作用：Control组的ROS、MDA和SOD水平分别是100﹪、（35.84±2.22）μmol/?g、（53.03±3.16） U/mg;F组的ROS、MDA和SOD水平分别是（184.6±11.33）﹪、（74.78±5.30）μmol/g、（29.26±0.85）U/mg;G组的ROS、MDA和SOD水平分别是（126.5±7.57）﹪、（41.95±3.43）μmol/g、（52.61±2.26）U/mg;H组的ROS、MDA和SOD水平分别是（174.7±5.50）﹪、（67.69±1.52） μmol/g、（35.33±1.95） U/mg,I组的ROS、MDA和SOD水平分别是（98.03±2.86）﹪、（37.66±2.49）μmol/g、51.14 U/mg（F = 112.0,P < 0.001;F = 93.73,P < 0.001;F = 84.92,P < 0.001）。 结论H₂S通过调控SIRT1抑制DOX诱导的H9c2细胞损伤。     

下调TLR4对LPS诱导的支气管上皮16HBE细胞损伤的影响及其机制

目的探讨TLR4对脂多糖（LPS）诱导的支气管上皮16HBE细胞损伤的影响及其机制。 方法将3条siRNA-TLR4-1、siRNA-TLR4-2和siRNA-TLR4-3转染至16HBE细胞中,筛选出最佳的siRNA-TLR4干扰序列进行实验。实验分为对照组（未处理）、LPS组（给予50 μg/ml LPS处理）、LPS+siNC组（转染siRNA-NC后给予50 μg/ml LPS处理）和LPS+siTLR4组（分别转染设计的3条siRNA-TLR4后给予50 μg/ml LPS处理）,采用RT-PCR检测TLR4、IL-6和TNF-α mRNA的表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western Blot检测Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κB p65和IκBα蛋白的表达。多组间比较使用单因素方差分析,组间多重比较采用SNK-q,两组间比较采用独立样本t检验。 结果LPS组与LPS+siTLR4-2组TLR4 mRNA（2.05±0.12,3.28±0.15）和蛋白表达（0.38±0.03,0.77±0.05）比较,差异具有统计学意义（t?= 11.091,11.585,P均< 0.001）;LPS组与LPS+siTLR4-3组TLR4 mRNA（1.39±0.09,3.28±0.15）和蛋白表达（0.31±0.02,0.77±0.05）比较,差异具有统计学意义（t?= 20.857,12.650,P均?< 0.001）且siRNA-TLR4-3的效果最为显著。与对照组相比,LPS组、LPS+siNC组和LPS+siTLR4组细胞中IL-6 mRNA（11.42±1.05,11.38±1.34,6.22±0.35,0.97±0.06,F?= 98.803,P均< 0.01）、TNF-α mRNA（15.76±1.12,15.69±0.87,7.54±0.41,1.03±0.09,F?= 278.064,P均< 0.01）、Cleaved Caspase-3蛋白（0.75±0.06,0.77±0.05,0.38±0.03,0.13±0.02,F?= 154.851,P均< 0.01）、Bax蛋白（0.48±0.05,0.52±0.05,0.33±0.02,0.11±0.02,F?= 71.310,P均< 0.01）、NF-κBp65蛋白（0.64±0.05,0.67±0.05,0.45±0.04,0.28±0.02,F?= 56.571,P?均?< 0.01）的表达水平和细胞凋亡率[（21.36±2.85）﹪,（20.94±3.22）﹪,（13.08±1.16）?﹪,（7.25±1.28）﹪,F?= 25.685,P均< 0.01]均明显升高,而细胞活力（0.53±0.04,0.51±0.04,0.78±0.06,1.15±0.08,F?= 80.811,P均< 0.01）和Bcl-2蛋白（0.28±0.03,0.25±0.03,0.40±0.03,0.69±0.06,F?= 76.762,P均< 0.01）、IκBα蛋白（0.38±0.03,0.35±0.03,0.44±0.03,0.72±0.06,F?= 53.635,P均< 0.01）的表达水平均明显降低;与LPS组相比,LPS+siTLR4组中IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白、NF-κBp65蛋白的表达水平和细胞凋亡率均明显降低,差异有统计学意义（t = 8.138,11.937,9.553,4.825,5.140,4.661,P均< 0.01）,而细胞活力和Bcl-2蛋白、IκBα蛋白的表达水平均明显升高,差异有统计学意义（t = 6.005,4.899,3.674,P < 0.05）,而LPS组和LPS+siNC组间差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论下调TLR4可通过抑制NF-κB通路激活抑制LPS诱导的细胞凋亡和炎症反应减轻16HBE细胞损伤。     

miR-214通过调控Notch1信号对口咽鳞状细胞癌细胞株增殖、侵袭及凋亡的作用机制研究

目的研究miR-214通过调控Notch1信号对口咽鳞状细胞癌（OSCC）细胞株增殖、侵袭及凋亡的作用机制。 方法在ATCC细胞库购买OSCC细胞株,分为3组：抑制组（IN组）、模拟组（SI组）及对照组（CO组）。通过Western blot法、qRT-PCR法、TUNEL法、侵袭实验及CCK-8法分析3组癌细胞中Notch1的蛋白、mRNA表达水平、细胞凋亡、迁移及增殖能力的差异性,三组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果IN、SI、CO组细胞内miR-214mRNA表达量分别为1.15±0.26,3.34±0.89,2.08±0.67,SI组分别与IN组、CO组比较,差异具有统计学意义（t = 5.281,P = 0.002;t = 2.529,P = 0.045）;SI组、IN组的Notch1-UTR表达分别为0.42±0.11、0.86±0.09,差异具有统计学意义（t = 5.362,P = 0.006）;IN、SI、CO组的OSCC细胞凋亡率分别为（0.78±0.10）﹪、（0.32±0.06）﹪、（0.56±0.12）﹪,IN组分别与CO组、SI组比较,差异具有统计学意义（t = 3.149,P = 0.020;t = 8.823,P < 0.001）;IN、SI、CO组癌细胞的增殖率分别为（0.65±0.05）﹪、（1.26±0.06）﹪、（1.89±0.04）﹪,IN组与SI组、IN组与CO组比较,差异具有统计学意义（t = 11.056,P < 0.001;t = 27.394,P < 0.001）,CO组与SI组比较,差异具有统计学意义（t = 12.365,P < 0.001）;IN、SI、CO组癌细胞侵袭率分别为（0.13±0.02）﹪、（0.89±0.13）﹪、（0.48±0.11）﹪,SI组与CO组、SI组与IN组比较,差异具有统计学意义（t = 4.176,P = 0.006;t = 10.147,P < 0.001）;IN、SI、CO组的Notch1蛋白含量分别为：2.38±1.34、0.94±0.23、1.76±0.67,SI组与CO组、SI组与IN组比较,差异具有统计学意义（t = 2.588,P = 0.041;t = 2.368,P = 0.056）;IN、SI、CO组的Notch1 mRNA表达量分别为4.26±1.06、1.45±0.38、2.46±0.87,IN组与CO组、IN组与SI组比较,差异具有统计学意义（t = 2.935,P = 0.026;t = 5.583,P = 0.001）。 结论miR-214可能与OSCC细胞株增殖呈负相关,在细胞中miR-214含量升高,可能抑制Notch1信号通路表达,从而促进癌细胞增长、侵袭,抑制癌细胞凋亡。     

艾拉莫德增强丝裂霉素C诱导的人食管癌Eca109细胞凋亡

目的探讨艾拉莫德增强丝裂霉素C（MMC）诱导的人食管癌Eca109细胞凋亡的作用及其机制。 方法将人食管癌Eca109细胞分为五组：对照组、MMC组、25,50,100 μg/ml浓度艾拉莫德+MMC组;通过CCK-8和DCFH-DA染色法分别检测25,50,100 μg/ml浓度艾拉莫德联合MMC对人食管癌Eca109细胞活力和细胞活性氧（ROS）生成的影响,流式细胞术检测艾拉莫德联合MMC对人食管癌Eca109细胞凋亡的影响,并通过Western Blot检测艾拉莫德联合MMC对TNF-α和cleaved caspase3蛋白表达的影响。采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析。 结果CCK-8结果显示,与0 μg/ml T-614+MMC组A450值（0.85±0.03）比较,25、50、100 μg/ml T-614+MMC组A450值（0.73±0.02,0.52±0.02,0.33±0.02）均降低,差异具有统计学意义（F = 127.60, P < 0.01）;DCFH-DA染色检测结果显示,与0 μg/ml T-614+MMC组DCFH荧光值（130.00±10.00）比较,25、50、100 μg/ml T-614+MMC组DCFH值（219.67±9.50,280.33±10.50,338.33±16.07）均升高,差异具有统计学意义（F = 170.20,P < 0.01）;流式细胞术检测结果显示,与对照组的细胞凋亡率（5.33±0.35）﹪比较,T-614和MMC组的凋亡率（20.30±2.00）﹪,（25.60±3.00）﹪均升高。与MMC组细胞凋亡率（25.60±3.00）﹪比较,艾拉莫德与MMC联用组（T-614+MMC）食管癌Eca109细胞的细胞凋亡率（56.20±3.00）﹪升高,差异均具有统计学意义（F = 247.50,P < 0.01）;Western Blot结果显示,与MMC组细胞TNF-α和cleaved caspase3蛋白表达（0.87±0.06,0.25±0.03）比较,艾拉莫德与MMC联用组（T-614+MMC）食管癌Eca109细胞的TNF-α和cleaved caspase3蛋白表达（1.28±0.08,0.59±0.03）升高,差异均具有统计学意义（F = 96.90,P < 0.01）。 结论艾拉莫德能够增强MMC对食管癌Eca109细胞活力的抑制作用,其机制可能通过促进ROS的生成,激活线粒体凋亡通路,最终导致食管癌Eca109细胞凋亡。     

TM4SF1在成纤维细胞与脐带间充质干细胞表达差异的研究

目的寻找成纤维细胞与脐带间充质干细胞（UCMSC）在细胞表面蛋白与分化能力方面的差异。 方法流式细胞术分析细胞表达CD105、CD90、CD73、CD44、CD14、CD34、CD45、CD79a、HLA-DR、FSP-1及TM4SF1的表达情况;细胞分化实验：观察成纤维细胞与UCMSC的成脂、成软骨及成骨能力;RT-PCR检测二者FSP-1、TM4SF1表达情况。两种细胞表型比较采用独立样本t检验。 结果成纤维细胞与UCMSC的表面分子CD105、CD90、CD73、CD44、CD14、CD34、CD45、CD79a、HLA-DR表达相似（P均> 0.05）,都具有成脂、成软骨、成骨的分化能力;成纤维细胞与UCMSC FSP-1阳性细胞比例分别为（98.6±0.3323）﹪及（98.90±0.2665）﹪（t = 0.4677,P = 0.5294）;UCMSC TM4SF1阳性细胞比例为（97.23±0.2250）﹪,成纤维细胞TM4SF1阳性细胞比例为（0.0082±0.0018）﹪（t = 346.9,P < 0.01）。 结论TM4SF1在成纤维细胞与UCMSC上的表达量存在差异。     

口腔鳞状细胞癌患者外周血Naa10及淋巴细胞免疫分型的特点及临床意义

目的探讨口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者外周血N-α-乙酰基转移酶10 （Naa10）及淋巴细胞免疫分型的特点,并分析其临床意义。 方法选取97例OSCC患者及50名健康体检者,分别纳入患者组、对照组。检测两组受试者外周血Naa10、淋巴细胞免疫分型,并比较不同TNM分期、不同淋巴结转移状态患者外周血Naa10、淋巴细胞免疫分型的差异,总结其特点与临床意义。不同性别人数采用χ²检验,计量资料行正态性检验,满足正态性且组间方差相等则采用t检验,不满足正态性则采用非参数Wilcoxon秩和检验,相关性分析采用Pearson法。 结果患者组血清Naa10为（62.91±17.15）pg/ml,高于对照组的（38.82±9.04）pg/ml,差异有统计学意义（t?= 9.280,P?< 0.05）。患者组CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、NK细胞百分比分别为（71.63±9.11）﹪、（34.34±4.26）﹪、（1.03±0.28）、（14.23±4.61）﹪,低于对照组的（76.25±2.87）﹪、（45.41±7.08）﹪、（1.77± 0.39）、（19.96±5.13）﹪,CD8⁺、B淋巴细胞百分比分别为（14.23±4.61）﹪、（14.91±3.29）﹪,高于后者的（19.96±5.13）﹪、（9.11±2.60）﹪,差异有统计学意义（P?< 0.05）。TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者42例,其血清Naa10为（64.08±15.26）?pg/?ml,与Ⅲ~Ⅳ期患者的（61.71±13.15）pg/ml比较,差异无统计学意义（t?= 0.820,P?> 0.05）。淋巴结转移者34例,其血清Naa10为（65.15±14.07）pg/ml,与无淋巴结转移者的（61.45±12.66）?pg/?ml比较,差异无统计学意义（t?= 1.321,P?> 0.05）。Ⅰ~Ⅱ期患者CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、NK细胞百分比低于Ⅲ~Ⅳ期患者,其CD8⁺、B淋巴细胞百分比高于后者,差异有统计学意义（P?< 0.05）。Pearson相关性分析示,外周血Naa10与CD3⁺ （-0.631）、CD4⁺ （-0.529）、CD4⁺/CD8⁺ （-0.587）、NK细胞百分比（-0.603）呈负相关,与CD8⁺ （0.558）、B淋巴细胞百分比（0.670）呈正相关（P?< 0.05）。 结论OSCC患者外周血Naa10明显升高但与TNM分期、淋巴结转移无关;其淋巴细胞免疫分型存在明显改变,且TNM分期的上升、淋巴结转移的发生伴随着CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/?CD8⁺、NK细胞百分比的下降,以及CD8⁺、B淋巴细胞百分比的上升。     

间充质细胞外泌体促进小鼠胰岛内皮细胞血管生成的研究

目的探讨间充质细胞（MSC）外泌体对低氧条件下胰岛内皮细胞（MS-1）血管生成的影响。 方法MSC无血清低氧条件培养48?h,超滤离心法富集条件培养基中的外泌体,采用电镜和Western Blot的方法进行鉴定;通过血管形成试验比较分析不同条件下：常氧培养组（NOR组,21﹪O₂、5﹪CO₂）、低浓度氧培养组（HYP组,2﹪O₂、5﹪CO₂）、外泌体+低浓度氧共培养组（HYP+EXO组,2﹪O₂、5﹪CO₂）,MS-1细胞的血管形成能力;image J软件分析血管形成长度;PCR、Q-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF） RNA水平的表达,Western Blot检测VEGF、HIF1α蛋白水平表达以及mTOR信号通路激活情况。采用单因素方差分析和SNK-q检验统计学分析。 结果超滤离心法富集的MSC条件培养基中的外泌体,大小为30 ~ 100 nm,表达CD9,CD63,CD81等外泌体表面标志物;血管形成试验结果显示,低氧促进MS-1血管生成,HYP+EXO组形成明显的血管网状结构;HYP+EXO组血管形成相对长度（2386.0±137.7）像素与NOR组（393.3±174.2）像素和HYP组（1467.0±230.0）像素相比增强,差异有统计学意义（t = 12.30,P?= 0.0065;t = 15.74,P = 0.0040）;PCR结果显示,HYP+EXO组VEGF相对表达量（20.26±9.972）较常氧对照组（1.000）和低氧组（6.521±3.501）均增强,差异有统计学意义（t = 5.462,P = 0.0009;t = 4.238,P = 0.0038）;同时,Western Blot结果显示VEGF蛋白水平表达升高,HIF1-α表达上调,mTOR发生磷酸化。 结论MSC外泌体可促进低氧条件下的小鼠胰岛内皮细胞血管生成。MSC外泌体可能通过上调HIF1-α,调节VEGF表达,激活mTOR信号通路,促进胰岛内皮细胞血管生成。     

ω-3 PUFAs对小鼠炎症性肠病调节性T细胞影响的研究

目的探究ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFAs）对小鼠炎症性肠病（IBD） CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）的影响。 方法选取新疆医科大学第五附属医院实验动物中心提供健康雄性Balb/C小鼠120只,均采用三硝基苯磺酸诱导成IBD模型,根据腹腔注射药物随机分为空白对照组（生理盐水）、ω-3 PUFAs组[2.5g/（kg·d）浓度ω-3 PUFAs]、硬脂酸对照组（饱和脂肪酸硬脂酸）、二十二碳六烯酸（DHA）组。各组小鼠组织学评分,Treg细胞表型,胞内细胞因子mRNA表达水平,上清液中细胞因子水平比较采用单因素方差分析。 结果与空白对照组比较,硬脂酸空白对照组、DHA组与ω-3 PUFAs组小鼠组织学评分[（4.12±0.89）分比（3.82±0.51）分、（2.51±0.74）分、（1.04±0.36）分] 、干扰素（IFN）-γ水平[（203.51±10.29） pg/mL比（165.32± 11.67） pg/mL、（128.34±6.77）pg/mL、（105.29±6.81）pg/mL]均下降,CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞表型比例[（3.80±0.89）﹪比（7.22±1.13）﹪、（3.90±0.75）﹪、（10.10±1.29）﹪]、细胞Foxp3 mRNA表达水平[（96.74±6.65）比（107.33±6.82）、（122.67±8.53）、（165.22±10.43）]、白细胞介素10（IL-10） mRNA表达水平[（0.59±0.18）比（0.98±0.29）、（1.22±0.59）、（1.47±0.53）]、上清液中细胞因子IL-10水平[（83.51±4.67） pg/mL比（108.35±7.22）pg/mL、（122.29±15.33）pg/mL、（153.67±15.28） pg/mL]、Foxp3水平[（9.65±1.29）pg/mL比（13.73± 1.32）pg/mL、（15.67± 2.57）pg/mL、（19.53±2.18）pg/mL]均升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）;与硬脂酸对照组比较,ω-3 PUFAs组与DHA组细胞Foxp3、IL-10 mRNA表达水平、上清液中细胞因子IL-10、Foxp3水平均升高,IFN-γ水平降低,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。 结论ω-3 PUFAs可以有效调节IBD小鼠免疫功能紊乱,减轻机体炎症水平,为IBD治疗提供新思路。     

低强度超声对HeLa肿瘤细胞凋亡的诱导作用及其机制

目的探讨低强度超声在诱导HeLa肿瘤细胞凋亡中的作用及其机制。 方法将体外培养的HeLa肿瘤细胞根据超声干预强度分为阴性对照组（切断电源后给予假的超声干预）和0.5、1.3、2.0 W/cm²超声干预组,分别通过MTT实验测定细胞活力、存活率,HE染色检测细胞形态,细胞凋亡实验检测细胞凋亡率,流式细胞术测定ROS含量及Western blot实验检测caspase-12、survivin和内参蛋白β-actin的表达情况。多组间比较采用单因素方差分析,各个实验组与对照组比较采用Dunnet-t检验。 结果与阴性对照组比较,0.5、1.3、2.0 W/ cm²超声干预组的HeLa肿瘤细胞活力[（99.23±1.56）﹪比（80.52±1.72）﹪、（54.31±1.69）﹪（27.75±1.26）﹪]、细胞存活率[（99.91±1.51）﹪比（76.69±1.92）﹪、（52.57±1.63）﹪、（29.81±1.22）﹪]、survivin蛋白表达（51.19±0.21比43.46±0.34、25.28±0.29、18.32±0.3）均降低,ROS含量（11.21±0.45比24.34±1.23、38.26±2.47、52.18±1.56）,细胞凋亡率[（4.23±1.21）﹪比（24.16±1.91）﹪、（48.34±1.66）﹪、（70.27±0.98）﹪]、caspase-12蛋白表达（13.05±0.21比20.23±0.19、33.17±0.32、41.52±0.21）均升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。 结论低强度超声可能通过诱导HeLa肿瘤细胞中caspase-12蛋白表达增加和survivin蛋白表达的减少而使HeLa肿瘤细胞发生凋亡。     

TLRs信号通路激活的MSCs外泌体对巨噬细胞极化的影响

目的探讨Toll样受体（TLR）3和4信号通路激活的间充质干细胞外泌体（MSCs-Exo）对巨噬细胞极化的影响。 方法差速贴壁法体外培养大鼠骨髓源MSCs,用外泌体提取试剂盒分别提取MSCs、TLR3信号通路激活的MSCs、TLR4信号通路激活的MSCs培养上清中的外泌体。用含10%FBS、10%L929条件培养基的RPMI-1640培养得M0型巨噬细胞,实验分6组：对照组及MSCs-Exo、TLR3信号通路激活的MSCs-Exo、TLR4信号通路激活的MSCs-Exo、LPS、IL-4+IL-13分别与M0型巨噬细胞共培养,48 h后收集各组巨噬细胞光镜下观察形态,流式和qPCR检测免疫表型（CD206、Arg-1、TNF-α、iNOS）及炎症因子（CCL22、IL-1β、IL-6、IL-10）表达的改变。组间比较采用单因素方差分析及独立t检验进行统计学分析。 结果MSCs鉴定符合间充质干细胞特性,MSCs-Exo为双层膜囊泡结构,直径在40 ~ 200 nm之间,表达外泌体标志性蛋白CD9、HSP70;光镜下观察各组巨噬细胞形态,加MSCs-Exo及TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞呈长梭形,伪足较多;流式检测发现,加MSCs-Exo及TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞均高表达CD206（107.2±6.87、102.4±9.83、112.0±9.24 vs 56.0±7.38,F?=?47.234,P均< 0.001）、Arg-1（135.2±6.87、130.2±7.59、203.4±9.07 vs 117.8±9.12,F =109.827,P =?0.009、0.048、0.000）;低表达TNF-α（27.0±5.65、24.6±5.02、25.6±4.15 vs 36.6±7.09,F = 4.882,P = 0.046、0.015、0.017）,而MSCs-Exo刺激的巨噬细胞低表达iNOS（240.2 ± 8.43 vs 308.8±9.88,P < 0.001）;TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞iNOS表达差异无统计学意义（P > 0.05）。qPCR检测发现,加MSCs-Exo及TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞均高表达CCL22（2.277±0.744、1.570±0.209、1.642±0.443 vs 1.000±0.111,F = 23.654,P = 0.015、0.003、0.031）、IL-10（1.233±0.136、2.426±0.343、1.390±0.155 vs 1.000±0.130,F?= 103.251,P = 0.048、0.000、0.008）,低表达IL-1β（0.383±0.035、0.640±0.143、0.242±0.073 vs 1.000±0.082,F = 12.315,P = 0.000、0.005、0.000）、IL-6（0.386±0.066、0.655±0.046、0.533±0.090 vs 1.000±0.204,F = 30.140,P = 0.001、0.006、0.016）。 结论TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo均能促使巨噬细胞向M2型极化。     

人CD137抗体促进NK细胞对乳腺癌细胞特异性杀伤作用的体外研究

目的探讨人自然杀伤(NK)细胞在CD137抗体作用下通过抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)介导对乳腺癌细胞的杀伤作用。方法NK细胞表型和细胞因子检测实验分组:阴性对照组(未用人CD137抗体处理的NK细胞)、CD137抗体处理组(10μg/mL人CD137抗体处理4 h的NK细胞);NK细胞毒性检测实验分组:根据体系中是否添加NK细胞、人CD137抗体和西妥昔单抗分为8组。流式细胞术检测两组NK细胞表面CD16分子的表达情况,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测两组NK细胞培养上清液中干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度,乳酸脱氢酶(LDH)法检测8组反应体系中表皮生长因子受体(EGFR)高表达乳腺癌细胞系MDA-MB-231和EGFR低表达乳腺癌细胞系MDA-MB-453的杀伤比例,并采用t检验或析因分析进行统计学分析。结果与阴性对照组比较,CD137抗体处理组CD16+NK细胞比例(79.57﹪±0.92﹪比90.43﹪±0.67﹪)、细胞因子IFN-γ浓度[(388.90±7.02)pg/mL比(523.90±1.90)pg/mL]和TNF-α浓度[(20.59±4.09)pg/mL比(47.22±2.14)pg/mL]均升高,差异有统计学意义(P<0.05);MDA-MB-231细胞杀伤的三因素析因分析结果显示:NK细胞、人CD137抗体和西妥昔单抗3个因素分别对MDA-MB-231细胞的杀伤都有作用(F=5227.276、201.473、1792.242,P均<0.001),3个因素两两之间的交互作用对MDA-MB-231细胞的杀伤也都有作用(F=183.903、1517.187、33.483,P均<0.001),3个因素的二级交互作用差异有统计学意义(F=41.505,P<0.001)。结论人CD137抗体可增强NK细胞分泌细胞毒性因子IFN-γ和TNF-α的能力,同时可上调NK细胞表面CD16分子的表达,从而使得NK细胞可能通过西妥昔单抗介导的ADCC作用增强对表皮生长因子受体(EGFR)高表达乳腺癌细胞的杀伤作用。     

超声引导下前列腺穿刺联合外周血循环肿瘤细胞检测对前列腺癌预后分析

目的探讨超声引导下前列腺穿刺联合外周血循环肿瘤细胞(CTCs)检测对前列腺癌预后的预测效果。方法选取2011年1月至2017年12月期间于郑州大学第二附属医院收治的83例前列腺癌患者为研究对象,全部患者均根据超声引导下经直肠前列腺穿刺活检术确诊为前列腺癌,检测病理标本中CK34BE12、p63、α-甲酰基辅酶A消旋酶(AMACR)等免疫标志物的表达状况,并采用Cell Search细胞搜索系统检测外周血CTCs的数量,据此分为阳性组(≥5个/7.5 ml)和阴性组(<5个/7.5 ml)。分析穿刺组织中免疫标志物表达状况、外周血CTCs计数与患者临床病理特征、生存状况的相关性。各标志物的阳性例数、Gleason评分>7分的比例、TNM分期等定性资料的比较采用x^2检验或Fisher确切概率法,年龄、血常规、凝血功能、肝功能、PSA水平等定量资料的比较采用t检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析,采用多因素Cox比例风险回归模型分析患者预后的预测因素。结果(1)全部患者中外周血CTCs、穿刺组织中CK34BE12、p63、AMACR的阳性率分别为31.33、3.61、3.61、86.75。CTCs阳性组的AMACR阳性率为100.00,高于CTCs阴性组的80.70,差异有统计学意义(x^2=4.227,P<0.05)。(2)AMACR阳性组患者的血红蛋白(HB)低于AMACR阴性组[(123.66±13.33)g/L比(134.89±20.08)g/L,t=2.420,P=0.018],血小板(PLT)、血清谷丙转氨酶、D-二聚体(DD)、前列腺特异抗原(PSA)水平、Gleason评分>7分的比例均高于AMACR阴性组[(197.23±36.98)×10^9/L比(172.83±33.33)×10^9/L,t=2.062,P=0.042;(38.80±10.03)U/L比(31.46±7.83)U/L,t=2.317,P=0.023;(255.00±38.80)μg/L比(220.81±30.99)μg/L,t=2.785,P=0.007;(26.60±12.23)ng/ml比(17.90±8.88)ng/ml,t=2.263,P=0.026;45.83比9.09,x^2=3.916,P=0.048],差异有统计学意义(P<0.05)。CTCs阳性组患者的HB低于CTCs阴性组[(121.69±15.89)g/L比(132.73±18.85)g/L,t=2.767,P=0.007],血清碱性磷酸酶、DD、PSA水平、Gleason评分>7分、T3~T4期、M1期的比例均高于CTCs阴性组[(105.69±30.56)U/L比(88.89±35.58)U/L,t=2.205,P=0.030;(256.63±35.86)μg/L比(236.98±33.30)μg/L,t=2.368,P=0.020;(30.09±11.89)ng/ml比(23.33±10.99)ng/ml,t=2.533,P=0.013;57.69比33.33,x^2=4.381,P=0.036;30.77比8.77,x^2=4.981,P=0.026;50.00比17.54,x^2=9.390,P=0.002],差异有统计学意义(P<0.05)。(3)全部患者的中位生存时间为58.33个月,1、3、5年的生存率分别为88.95、51.81、30.12。AMACR阳性组、CTCs阳性组患者的中位生存时间为40.93、36.93个月,低于AMACR阴性组、CTCs阴性组的66.66、69.56个月,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox比例风险回归模型分析结果表明,Gleason评分>7分、M1期、AMACR阳性、CTCs阳性是患者死亡的独立危险因素(HR=1.883、3.666、2.009、2.923,P<0.05)。结论超声引导下前列腺穿刺联合外周血CTCs检测对前列腺癌患者的预后具有重要的预测价值,临床上可根据穿刺组织中AMACR表达水平和外周血CTCs计数进行预后的综合分析。     

Necrostatin-1 Against Sevoflurane-Induced Cognitive Dysfunction Involves Activation of BDNF/TrkB Pathway and Inhibition of Necroptosis in Aged Rats

Postoperative cognitive dysfunction (POCD) induced by anesthesia or surgery has become a common complication in the aged population. Sevoflurane, a clinical inhalation anesthetic, could stimulate calcium overload and necroptosis to POCD. In addition, necroptosis inhibitor necrostatin-1 (Nec-1) alleviated cognitive impairment caused by multiple causes, including postoperative cognitive impairment. However, whether Nec-1 exerts a neuroprotective effect on POCD via calcium and necroptosis remains unclear. We anesthetized Sprague–Dawley rats with sevoflurane to construct the POCD model and to explore the mechanism underlying neuroprotective effects of Nec-1 in POCD. Rats were treated with Nec-1 (6.25 mg/kg) 1 h prior to anesthesia. Open field test and Morris water maze were employed to detect the cognitive function. In this study, rats exposed to sevoflurane displayed cognitive dysfunction without changes in spontaneous activity; however, the sevoflurane-induced POCD could be relieved by Nec-1 pretreatment. Nec-1 decreased sevoflurane-induced calcium overload and calpain activity in the hippocampus. In addition, Nec-1 alleviated the expression of p-RIPK1, RIPK1, p-RIPK3, RIPK3, p-MLKL and MLKL. Furthermore, Nec-1 remarkably increased BDNF and p-TrkB/TrkB expression in the hippocampus of aged rats. Ultimately, our research manifests evidence that Nec-1 may play a neuroprotective role against sevoflurane-induced cognitive impairment via the increase of BDNF/TrkB and suppression of necroptosis-related pathway.

     

单倍体造血干细胞移植对儿童重型再生障碍性贫血治疗的并发症分析

目的分析儿童重型再生障碍性贫血(SAA)单倍体造血干细胞移植和同胞全相合移植并发症发生率。方法回顾性分析2010年1月1日至2018年12月31日于苏州大学附属儿童医院进行治疗的SAA患儿(56例),分为治疗组(单倍体造血干细胞移植,35例),对照组(同胞全相合移植,21例)。其中患儿年龄、诊断距离移植时间、总单个核细胞数、总CD34+细胞数、中位随访时间、粒细胞植入时间、血小板植入时间及等级资料[供受体血型相合程度、急性移植物抗宿主病(aGVHD)分级、广泛性慢性移植物抗宿主病(cGVHD)分级、出血性膀胱炎分级、渗漏综合征分级]采用Mann-Whitney U检验。性别、疾病种类、供体与受体性别、预处理方案、CD20单抗的使用、HLA配型、供体来源、移植物来源、植入综合征、巨细胞病毒(CMV)血症、EB病毒(EBV)血症、死亡人数、植入失败人数和骨髓增殖不良人数使用卡方检验进行组间分析。生存曲线以及累积发生率用Kaplan-Meier法绘制,并使用Log-rank检验分析组间差异。结果与对照组比较,治疗组CD19+B细胞的重建延迟,而CD16+CD56+NK细胞数量移植后6个月开始增加,逐渐达到对照组的水平。与对照组比较,治疗组aGVHD、cGVHD、植入综合征和骨髓增殖不良累积发生率(14.29﹪±7.64﹪比57.14﹪±8.36﹪,11.67﹪±7.75﹪比61.59﹪±9.65﹪,9.53﹪±6.41﹪比74.86﹪±7.43﹪,0.0﹪比14.29﹪±5.91﹪)均升高,差异具有统计学意义(P<0.05),两组CMV与EBV感染,5年总体生存率(OS)、无失败生存率(FFS)、无GVHD失败存活率(GFFS)、Ⅲ-Ⅳ度aGVHD及广泛性cGVHD累积发生率比较差异无统计意义(P>0.05)。结论单倍体移植是治疗儿童SAA的有效治疗方案,但与同胞全合造血干细胞移植比较,其GVHD发生率较高,植入综合征和骨髓增殖不良的发生率较高,优化单倍体移植方案有望降低并发症,提高儿童重型再生障碍性贫血的生活质量。     

阿加曲班对急性脑梗死大鼠脑组织细胞凋亡的影响

目的探讨阿加曲班对急性脑梗死大鼠脑组织细胞凋亡数量、caspase-3、Bcl-2和Bax表达的影响。方法建立SD大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,将大鼠分为假手术组(Sham组,不插入MCAO拴线)、脑中动脉缺血模型组(MCAO组)和阿加曲班处理组(Argatroban组)。分别选取0、6和12 h共3个时间窗的样本进行检测,TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒检测大鼠脑部神经细胞凋亡,Western blot和ELISA法检测大鼠脑部caspase-3、Bax和Bcl-2水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果TUNEL法结果显示,与MCAO组比较,Sham组和Argatroban组在0、6、12 h的细胞凋亡指数均降低[0 h(14.91±4.11)﹪比(2.13±0.58)﹪、(4.22±1.01)﹪;6 h(24.75±3.88)﹪比(3.19±0.28)﹪、(12.14±1.90)﹪;12 h(48.22±2.69)﹪比(5.75±1.21)﹪、(28.45±7.84)﹪,P均<0.05]。ELISA结果显示:与Sham组比较,MCAO组0、6、12 h的大鼠脑组织细胞caspase-3、Bax表达均升高,而Bcl-2表达在6、12 h时升高(P均<0.05);与MCAO组比较,Argatroban组的脑组织细胞caspase-3、Bax表达均降低,而Bcl-2表达在6、12 h时升高[caspase-3表达:0 h(2.32±0.12)比(1.25±0.06)、6 h(5.91±0.60)比(3.26±0.22)、12 h(7.31±0.27)比(6.42±0.18)ng/ml;Bax表达:0 h(0.82±0.08)比(0.45±0.03)、6 h(1.00±0.05)比(0.66±0.04)、12 h(1.56±0.11)比(1.09±0.07)ng/ml;Bcl-2表达:6 h(1.07±0.08)比(1.56±0.05)ng/ml,12 h(0.67±0.08)比(1.45±0.06)ng/ml,P均<0.01]。Western blot结果显示,大鼠脑组织细胞caspase-3、Bax蛋白表达趋势与ELISA结果一致;而Bcl-2蛋白表达在Argatroban组高于Sham组和MCAO组,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论阿加曲班可通过减少急性脑梗死诱导的大鼠脑组织细胞凋亡、抑制caspase-3和Bax表达,并上调Bcl-2水平而产生神经保护作用。     

高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤对程序性坏死的影响及其机制*

目的: 探讨程序性坏死在高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤中的变化及可能机制。方法: 原代大鼠心肌细胞随机分为4组(n=9):正常对照组(Control,5.5 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、HG+Nec-1(30 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L程序性坏死关键蛋白RIP1抑制剂Nec-1共同培养心肌细胞48 h)组、高渗组(HPG,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇共同培养心肌细胞48 h)。MTT法检测各组心肌细胞活力,DHE荧光染色检测细胞氧化应激水平,ELISA法检测心肌细胞TNF-α、IL-6及IL-1β水平,Real-time PCR和Western blot分别检测各组程序性坏死关键蛋白RIP1、RIP3、MLKL mRNA和蛋白水平的表达情况。结果: 与Control组相比,HG组心肌细胞活力明显降低(P＜0.01),氧化应激水平明显增高(P＜0.01),TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高明显(P＜0.01),RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均明显升高(P＜0.05);与HG组相比,HG+Nec-1组心肌细胞活力明显升高(P＜0.01),氧化应激水平明显下降(P＜0.01),TNF-α、IL-6及 IL-1β水平明显降低(P＜0.01), RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均下降(P＜0.05)。结论: 高糖诱导的原代大鼠心肌细胞损伤可引起程序性坏死的发生;抑制程序性坏死可减轻细胞损伤的机制,可能与抑制氧化应激、减轻炎症反应有关。     

骨髓间充质干细胞对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响。 方法选取2013年1月至2017年12月于福州总医院接受MSCs诱导+同种异体肾移植术的受者20例（MSCs组）,对照组为同期配对的异体肾移植受者20例。两组患者术后免疫抑制方案均为霉酚酸酯+他克莫司+强的松。两组患者分别于移植术前、术后第15天抽取静脉血,流式细胞仪检测外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞亚群比值;ELISA检测白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素10（IL-10）浓度;免疫磁珠分选外周血T淋巴细胞后,Rea1-time PCR法检测外周血T淋巴细胞中miRNA-?155的表达。两组间均数比较采用独立t检验,治疗前后均数比较采用配对t检验。 结果移植前两组肾移植受者外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞比值、IL-2、IL-?10、TNF-α、T淋巴细胞miRNA-155表达水平差异均无统计学意义（P均> 0.05）;术后第15天,与对照组相比,MSCs组外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞亚群比值（30.44﹪?± 4.23﹪? vs 26.06﹪?±4.77﹪,t = 2.365,P = 0.042）、IL-10水平（20.35?ng/?L?±?5.10?ng/?L? vs 16.63?ng/?L±6.26?ng/?L,t = 2.062,P?=?0.046）上升,而IL-2（27.47ng/?L±4.30 ng/?L vs 31.40?ng/?L±5.33 ng/L,t = 2.252,P = 0.015）、TNF-α（41.52?ng/?L±8.32?ng/L vs 46.67?ng/?L±6.71?ng/L,t = 2.157,P = 0.037）和T淋巴细胞miRNA-155表达水平（1.61±0.31 vs 1.89±0.15,t = 3.688,P?= 0.001）则降低。 结论MSCs能够升高肾移植受者外周血CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ Treg细胞/?CD4⁺细胞比值和IL-10水平,降低IL-2、TNF-α和T淋巴细胞miRNA-155表达水平,与MSCs的免疫耐受诱导有关。     

lncRNA MAGI2-AS3下调miR-31-5p抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡

目的研究lncRNA MAGI2-AS3对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响和潜在的分子机制。方法根据转染载体不同将A549细胞分为pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-MAGI2-AS3组(转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-31-5p组(转染anti-miR-31-5p)、pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组(共转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3和miR-NC)、pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-31-5p组(共转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3和miR-31-5p mimics)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-31-5p和MAGI2-AS3 RNA的表达,四氮唑蓝(MTT)法测定A549细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证MAGI2-AS3与miR-31-5p的调控关系,流式细胞术检测细胞凋亡与周期。两组间比较采用独立样本t检验进行分析;多组间比较采用单因素方差分析,组内多重比较采用SNK-q检验。结果与人正常肺细胞HBE相比,肺癌细胞A549中的MAGI2-AS3表达量(0.48±0.03比1.29±0.06)降低,miR-31-5p表达量(1.01±0.05比0.25±0.02)升高;与pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-MAGI2-AS3组A549细胞活力(0.48±0.04比0.77±0.06)、迁移[(81.33±2.87)个比(124.33±3.09)个]和侵袭[(32.00±2.83)个比(53.00±3.27)个]细胞数、S期细胞所占比例(23.01﹪±1.00﹪比32.95﹪±1.06﹪)均降低,凋亡率(19.95﹪±1.25﹪比7.23﹪±0.51﹪)、G0-G1期细胞所占比例(43.58﹪±2.15﹪比33.56﹪±1.23﹪)均升高;与anti-miR-NC组比较,anti-miR-31-5p组A549细胞活力(0.53±0.04比0.78±0.06)、迁移[(76.00±3.74)个比(108.33±2.87)个]和侵袭[(30.00±1.63)个比(42.33±2.05)个]细胞数、S期细胞所占比例(24.43﹪±1.13﹪比32.91﹪±1.08﹪)降低,凋亡率(18.21﹪±1.24﹪比7.29﹪±0.51﹪)、G0-G1期细胞所占比例(41.56﹪±2.19﹪比33.53﹪±1.27﹪)升高,差异有统计学意义(P均<0.05);双荧光素酶报告系统结果显示,MAGI2-AS3靶向负调控miR-31-5p的表达。与pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组比较,pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-31-5p组A549细胞活力(0.68±0.06比0.50±0.04)、迁移[(91.00±1.63)个比(52.67±2.62)个]和侵袭[(62.67±2.49)个比(31.67±4.03个)]细胞数升高,凋亡率(10.59﹪±1.0﹪比21.11﹪±1.14﹪)降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论lncRNA MAGI2-AS3通过靶向miR-31-5p抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。lncRNA MAGI2-AS3是肺癌潜在分子治疗靶点。