定量蛋白质组分析蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312介导的分枝杆菌耐红霉素机制（英文）

【目的】细菌耐药机制是个复杂的机制,系统生物学是系统性揭示耐药机制的有力研究手段。我们课题组前期研究结果显示,蚯蚓血红蛋白样蛋白msmeg_3312基因敲除后能够增加耻垢分枝杆菌对红霉素的耐药性,本文系统研究MSMEG_3312参与红霉素耐药性形成的机制。【方法】首先纯化MSMEG_3312蛋白,利用光谱及圆二色谱描述MSMEG-3312蛋白。利用定量蛋白质组学的方法比较分析敲除菌株Δmsmeg_3312与野生型菌株mc~2155蛋白表达的差异,并通过qRT-PCR进行验证。利用红霉素ELASA试剂盒测定Δmsmeg_3312与mc~2155的胞内药物浓度。【结果】光谱及圆二色谱分析确定MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白。定量蛋白质组学分析发现,红霉素未处理的条件下,相比于野生型菌株mc~2155,敲除菌株Δmsmeg_3312有包括3种转运蛋白在内的8种蛋白表达水平上调,14种蛋白表达下调;而红霉素处理后,Δmsmeg_3312中有448种蛋白差异表达,其中有11种转运蛋白表达上调,26种蛋白与氨基酸合成通路相关。胞内药物浓度检测显示敲除菌株Δmsmeg_3312的胞内红霉素浓度显著低于野生型菌株。【结论】蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312调控改变了细菌对红霉素药物处理的反应网络,其介导的红霉素耐药是一种集合抗生素耐受机制。     

耻垢分枝杆菌的蚯蚓血红蛋白样蛋白MSMEG_3312影响其大环内酯类药物的敏感性

【目的】活性氧类分子是机体有氧代谢的自然产物,可以引起氧化损伤,导致细胞DNA突变、蛋白质失活,是细菌耐药产生的原因之一。蚯蚓血红蛋白家族是能携带氧、可逆地结合氧的一类蛋白,在氧代谢过程中发挥重要作用,与活性氧类分子介导的细菌耐药相关。预测耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MSMEG_3312是蚯蚓血红蛋白样蛋白,其功能可能与细菌抗药性有关。【方法】通过生物信息学预测耻垢分枝杆菌MSMEG_3312的结构特征。通过基因敲除、遗传互补和抗药性分析以及启动子表达测定等方法研究MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌抗药的相关性。【结果】与野生菌株mc2155相比,msmeg_3312敲除菌株表现为抗大环内酯类抗生素,而且回补msmeg_3312部分丧失了这种耐药表型。此外,大环内酯类抗生素的胁迫在统计上显著下调msmeg_3312启动子的表达。另外,对作用于核糖体的其他药物,敲除菌株和野生菌株没有抗药性差异。【结论】生物信息学分析显示MSMEG_3312的氨基酸序列具有典型的蚯蚓血红蛋白保守的HHE结构域,预测其二级结构含有4个α-螺旋组成的典型蚯蚓血红蛋白结构。MSMEG_3312与耻垢分枝杆菌对大环内酯类抗生素的药物敏感性相关,其可能通过影响药物与核糖体50S亚基的作用来发挥功能。     

嗜水气单胞菌中转录因子AHA_1581对细菌生理功能调控机制的研究

[目的] LuxR家族转录因子能够抑制或刺激不同功能类型基因的表达,来维持细胞功能的稳定性。嗜水气单胞菌是水产养殖中重要的致病菌之一,目前对该菌中的LuxR家族转录因子功能的研究还较少。[方法] 本研究利用含有sacB标记的自杀载体pRE112和同源重组技术敲除LuxR家族转录因子AHA_1581基因。[结果] 生理表型测定结果发现,ΔAHA_1581的运动与胞外蛋白的酶活增强、生物被膜形成能力降低,且耐受低温、卡那霉素、庆大霉素胁迫,但是对K₂Cr₂O₇更加敏感。进一步对野生型Ah和ΔAHA_1581的定量蛋白质组学分析,共鉴定到2654个蛋白,其中59个蛋白下调表达,142个蛋白上调表达。生物信息学分析表明AHA_1581参与调控双组分调节系统、丙酮酸代谢、碳代谢、TCA循环等细菌重要生理过程,以及细菌耐药基因和毒力因子的差异表达。[结论] 了解AHA_1581基因在调控细菌毒力以及生物过程中所起的重要作用,对预防和控制嗜水气单胞菌引起疾病的发生和传播可能具有重要的科学意义。     

铜绿假单胞菌二鸟苷酸环化酶SiaD突变体的功能研究

【目的】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugionsa)二鸟苷酸环化酶SiaD调控着铜绿假单胞菌的生物被膜形成等表型。在研究过表达siaD对生物被膜的调控作用时发现,与野生型siaD基因回补菌株相比,一株回补菌株的生物被膜产量显著升高。本文的目的即是探究该菌株生物被膜产量升高的原因,并对该菌株的其他表型进行研究。【方法】通过测序确定突变位点;利用生物被膜定性和定量实验对发生点突变的菌株表型进行分析;利用Western blotting实验检测SiaD^R119M蛋白表达水平;利用GST-pull down实验检测SiaC蛋白与SiaD^R119M蛋白在体外的结合能力;针对siaD^R119M点突变基因进行融合蛋白表达载体的构建,表达并纯化该蛋白,利用高效液相色谱检测SiaD^R119M的酶活;为了进一步研究c-di-GMP与细菌运动能力的关系,对细菌的运动能力进行检测。【结果】测序比对结果显示,序列的第119个氨基酸发生了突变,由精氨酸突变成了甲硫氨酸。生物被膜定性和定量实验显示,与野生型siaD回补菌株相比,siaD^R119M的回补菌株生物被膜产量增加,siaD^R119A的回补菌株生物被膜产量低于siaD^R119M的回补菌株,siaD^R201A回补菌株生物被膜含量显著增加,siaD^{R119M R201A}双突变回补菌株生物被膜的含量低于siaD^R201A回补菌株。Western blotting和GST-pull down实验证明,与野生型SiaD蛋白相比,SiaD^R119M蛋白表达水平无差别,SiaC和SiaD^R119M蛋白之间存在特异的相互作用。高效液相色谱结果显示SiaD^R119M蛋白酶活降低。运动能力检测实验中,与siaD野生型回补菌株相比,siaD^R119M回补菌株运动能力减弱,siaD^R201A、siaD^{R119M R201A}回补菌株运动能力无差别。【结论】siaD^R119M突变导致生物被膜合成增强,酶活降低,运动能力减弱。我们推测突变后表型的变化可能是因为突变在体内会影响SiaD蛋白与下游效应蛋白的相互作用,加强了下游效应蛋白的信号传导能力,然而具体机制有待进一步探索。     

NirA1基因对球孢白僵菌生长、抗逆及毒力的影响

[目的] 探究参与硝酸盐同化的一个特异转录因子NirA1对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）生长、抗逆及毒力的影响。[方法] 利用RT-PCR检测球孢白僵菌NirA1基因在不同培养基中的表达特征。通过构建敲除突变株ΔNirA1、超量表达OENirA1及回复互补菌株ComNirA1,解析NirA1在球孢白僵菌生长发育、逆境胁迫反应和致病昆虫中的功能。[结果] NirA1基因在营养较贫瘠的CZB培养基中表达量高于丰富培养基PDB和SDB。敲除NirA1导致了菌株在人工培养基上的生长缓慢,对NaNO₂和Urea的利用效率降低。RT-PCR显示,ΔNirA1中硝酸盐转运蛋白基因NrtA的表达较野生型显著下调。在CZA、PDA和1/4 SDAY培养基中,其分生孢子产量分别较野生型降低了21.6%、16.2%和25.6%。逆境胁迫分析发现,在高温（32℃）,高渗（1 mol/L NaCl）和H₂O₂处理后,ΔNirA1菌落生长抑制率较野生型分别降低29.0%、25.2%及49.0%;但在添加SDS和刚果红（CR）的处理中,突变体菌落的生长抑制率分别较野生型升高34.1%和96.2%。因此,缺失NirA后,菌株对SDS和CR更加敏感,但对高温、H₂O₂和NaCl的耐受性提高。以3龄的大蜡螟为试虫的毒力测定表明,敲除NirA1基因导致菌株的毒力提高,半致死时间较野生型提前17.4%。[结论] NirA1在球孢白僵菌生长过程中参与了氮源的利用,并在球孢白僵菌的菌落生长、分生孢子生产、胁迫反应和致病宿主过程中发挥了重要作用。     

核桃细菌性黑斑病菌rpfG基因的功能分析

[目的] 本研究旨在揭示核桃细菌性黑斑病菌（Xanthomonas arboricola pv.juglandis,Xaj） DW3F3中rpfG基因的生物学功能,从而为核桃细菌性黑斑病防治药剂的开发提供作用靶点。[方法] 以野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）8004菌株以及水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo） PXO99^A的rpfG基因为模板序列,对Xaj野生型菌株DW3F3的基因组序列进行检索。利用同源重组技术,对Xaj中rpfG基因进行敲除,并用生物化学方法对基因缺失菌株的相关毒力因子、抗逆性进行检测。[结果] 通过同源比对,在XajDW3F3的基因组中发现了与XccrpfG、XoorpfG同源的基因,并成功获得rpfG的缺失突变株ΔrpfG。与野生型相比,突变株ΔrpfG的生物被膜形成能力仅为野生型XajDW3F3的44.58%;胞外多糖产量也由野生型的8.47 mg/mL降为5.23 mg/mL;ΔrpfG的絮凝活性增加,能使菌液变澄清;运动性实验显示ΔrpfG的运动直径比野生型增加了12.38%;胞外酶的分泌也发生了不同程度的改变,突变株分泌纤维素酶的能力极显著降低,淀粉酶活性有所提高,而分泌蛋白酶的能力未发生变化;此外rpfG缺失后,Xaj对逆境（盐、酸、SDS、硫酸铜）的耐受力降低。[结论] 结果表明rpfG基因能影响核桃细菌性黑斑病菌的致病相关性状,并赋予了细菌一定的抗逆性。     

利用CRISPR-Cas9技术构建敲除VDH的产香兰素拟无枝酸菌

[目的] 建立适用于拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）的CRISPR-Cas9基因编辑系统,敲除其编码香兰素脱氢酶基因（VDH）,减少发酵副产物香草酸。[方法] 以VDH为靶标基因,将pKCcas9dO质粒上的tipA、j23119启动子分别替换为pRLE6质粒Km^r启动子、链霉菌中常用的强启动子permE*,同时将sgRNA替换为能识别靶基因香兰素脱氢酶的特异性sgRNA,获得质粒pKCKmCas9VDH。然后将其与靶基因的上下游同源臂连接,获得敲除质粒pLYZYP01。将pLYZYP01质粒电转进Amycolatopsis sp.感受态细胞,筛选获得VDH的敲除突变体菌株。[结果] 利用上述方法,成功获得VDH敲除菌株Amycolatopsis sp.ΔVDH。[结论] 建立了适用于拟无枝酸菌CCTCC M 2011265的基因敲除系统,成功敲除VDH基因,在添加12 g/L底物阿魏酸的情况下,香兰素产量达到9.19 g/L,摩尔转化率由88.6%提高到97.7%。     

大肠杆菌Zn2+敏感突变株构建及其功能验证

【背景】Zn²⁺在细胞解毒及许多生理过程中发挥着关键作用,Zn²⁺转运蛋白已逐渐引起人们的重视。在大肠杆菌中,zntA和zitB是2个外排Zn²⁺的关键基因。【目的】构建大肠杆菌Zn²⁺敏感突变株,并对其功能进行验证。【方法】以Escherichia coli DH5α为出发菌株,利用λ Red重组系统,通过携带卡那霉素抗性基因的同源重组片段敲除zntA基因。在单基因敲除菌株基础上,利用携带庆大霉素抗性基因的同源重组片段敲除zitB基因,获得一株敲除了zntA和zitB的双基因敲除菌株KZAB04。通过功能互补实验检测基因敲除菌株及对照菌株对不同浓度Zn²⁺的敏感程度。【结果】基因敲除菌株KZAB04比出发菌株E.coli DH5α具有更高的Zn²⁺敏感性。【结论】大肠杆菌Zn²⁺敏感突变株构建成功。该菌株的构建为zntA和zitB基因功能的研究提供了必要条件,同时也为其他Zn²⁺转运蛋白基因的功能鉴定与分析奠定了基础。     

关键酶基因转录水平对重组大肠杆菌合成NAD+的影响

[目的] 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide）是生物体内一种重要的辅因子,其细胞内含量对于NAD⁺依赖型氧化还原反应和有关生化合成代谢具有重要意义。为强化辅因子合成,本文通过不同诱导条件下关键酶基因转录水平与产物合成水平的相关性分析,利用增加正向关键酶基因拷贝数策略提高胞内氧化型辅酶NAD⁺的浓度。[方法] 以实验室前期构建的大肠杆菌NA016为出发菌株,分别从诱导温度、诱导剂浓度、诱导时机三个方面进行了诱导条件的优化,并利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对代谢改造中的有关过表达基因进行了转录水平分析,确定了NAD⁺含量与这些过表达基因转录水平之间的相关性,增加对NAD⁺合成代谢具有正向作用的基因拷贝数以进一步提高胞内NAD⁺水平。[结果] 通过诱导条件优化实验确定菌株NA016的最适诱导温度,在诱导时机为OD₆₀₀达到0.6时加入0.8 mmol/L的IPTG可使胞内NAD⁺含量提高35.37%;转录水平方面分析发现基因nadE和pncB的表达对NAD⁺的合成具有正向调节作用。进一步增加菌株NA016中关键酶基因nadE和pncB的拷贝数可使辅酶含量再次提高22.46%,最高可达41.66μmol/g DCW。[结论] 优化诱导条件和增加关键酶基因拷贝数可以提高氧化型辅酶NAD⁺的含量,这为促进大肠杆菌胞内NAD⁺合成的研究提供借鉴意义。     

嗜水气单胞菌ntrC调控的生理功能及其机制研究

[目的] NtrC是一种与DNA结合的转录调控因子,在激活氮同化基因的转录和维持氮源供应中具有重要作用,本研究拟探究其对嗜水气单胞菌生理功能的影响及其作用机理。[方法] 本研究采用同源重组方法构建了嗜水气单胞菌ATCC 7966 ntrC的缺失株,并以野生株为对照,对缺失株的生理表型进行测定和分析,利用定量蛋白质组学技术比较野生株和ntrC缺失株的蛋白表达差异。[结果] 发现敲除ntrC基因后,嗜水气单胞菌在缺氮、渗透压、重金属离子、氧化以及不同抗生素胁迫下的耐受性都发生显著变化,且这些表型在其补救菌株中均能得到恢复。定量蛋白质组学分析发现,野生株和ntrC缺失株的差异表达蛋白可能参与氨基酸生物合成、抗坏血酸和醛糖酸盐等代谢通路的调控。[结论] 本研究阐明了ntrC在嗜水气单胞菌中的重要作用及其对细菌生物学功能的影响,探讨了ntrC直接或间接调控的蛋白与生理表型之间的联系,研究结果可为未来水产致病菌的防治提供理论支持。     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失.自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的.     

Development of a Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2

In conclusion, the novel visual RT-LAMP assay is a simple, rapid, and sensitive approach for detection of SARS-CoV-2, and it is ready for application in primary care and community hospitals or health care centers, and even patients' own houses in response to the current SARS-CoV-2 epidemic because the assay does not require sophisticated equipment and skilled personnel. Furthermore, it is also ready to be used in fields for screening samples from wild animals and environments to facilitate the identification of potential intermediate hosts that mediate the cross-species transmission of SARS-CoV-2 from bats to humans.     

Perinatal Vertical Transmission of Chikungunya Virus in Ruili,a Town on the Border between China and Myanmar

正Dear Editor,Chikungunya virus (CHIKV), an arbovirus in the family of Togaviridae, genus Alphavirus, is transmitted by the A.aegyptii or A. albopictus mosquito, and causes disease in humans characterized by fever, rash, and arthralgia (Silva and Dermody 2017; Suhrbier 2019). It was first reported in 1953 in Tanzania, and caused only a few outbreaks and sporadic cases in Africa and Asia in last century. However, in the epidemic in 2004, CHIKV acquired mutations that conferred enhanced transmission by the A. albopictus mosquito(Schuffenecker et al. 2006). Since then, it has successively caused outbreaks in Africa, the Indian Ocean, South East Asia, the South America, and Europe (Zeller et al. 2016).