单域重链抗体的分子特征

源于软骨鱼或骆驼科动物的同型重链二聚体无轻链,用基因工程方法获得其单一重链可变区可保留完整的抗原结合活性,称为单域重链抗体。单域重链抗体具有分子小、稳定性高、体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的结构特征,近年来在生物技术研究与诊断治疗应用领域得到广泛关注,取得了快速发展。     

基于重链抗体构建的单域抗体研究进展

在骆驼血清中存在天然的缺失轻链的重链抗体(heavy chainantibody ,HCAb) ,克隆重链抗体的可变区构建的只由一个重链可变区组成的单域抗体称为VHH抗体(variabledomainofheavychainofheavy chainantibody ,VHH)。研究发现,VHH抗体具有易表达、可溶性好、稳定性强等优点。另外,骆驼的重链抗体与人VH3家族抗体同源,对人VH3家族抗体的重链可变区进行类似VHH的特征性改造,可以使这些抗体在保持亲和力、特异性不变或者变化很小的情况下,优化抗体的其它性质。已有的研究表明VHH抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。     

纳米抗体研究进展

纳米抗体是由骆驼科动物缺失轻链的天然重链抗体的可变区(VHH)组成的单域抗体,其可变区的相对分子质量约为15×10~3。与传统抗体相比,纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。基于纳米抗体的特性以及骆驼天然重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构,使其在基础医学研究以及疾病诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。     

抗A型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达

以获得的抗A型肉毒毒素人源单链抗体ScFvB17为模板 ,PCR扩增抗体ScFv基因的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (Vκ) ,以重链恒定区 1(CH1) 5′端 12个氨基酸的序列作为连接肽 ,构建成三结构域抗体分子 :VH_连接肽_Vκ(VH Vκ)。重组VH Vκ抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白质的 34%以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体 ,采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化 ,得到了纯度高达 95 %的VH Vκ。ELISA等实验结果显示 ,重组设计并制备的三结构域抗体蛋白VH Vκ不但可以特异识别毒素抗原 ,具有与原母本单链抗体ScFv相同的抗原特异性 ,而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。     

基因工程二硫键抗体

二硫键抗体(dsFv)的概念最早出现于1990年,它是将抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)的各一个氨基酸残基突变为半胱氨酸,通过链间二硫键连接抗体可变区(Fv)的片段抗体.通用的突变位点是重链的44位和轻链的100位或重链的105位和轻链的43位.dsFv最显著的优点是生化性质稳定,能够耐受环境条件的剧烈作用,在血液中的半衰期长达14 d以上,符合临床给药要求.动物实验显示,dsFv-毒素在不对动物造成毒副作用的情况下,可完全抑制肿瘤生长.     

鲨源单域抗体的研究进展

单克隆抗体是重要的生物大分子,在免疫检测、体外诊断以及药物开发等领域获得广泛的应用。但是单克隆抗体的分子量大、结构复杂等固有属性正日益成为制约其进一步发展的关键因素。因此,当前迫切需要开发单克隆抗体的替代品。鲨源单域抗体即鲨源新抗原受体可变区(Variabledomainofimmunoglobulinnew antigenreceptor,VNAR),是基于鲨总目鱼类天然存在的新抗原受体(Immunoglobulinnewantigenreceptor,IgNAR)并通过基因工程技术获得的抗原结合域,其分子量仅为12kDa,是目前已知脊椎动物中尺寸最小的抗原结合域。鲨源单域抗体具有分子量小、亲和力高、稳定性强、溶解度好、组织穿透性强以及可识别隐藏抗原表位等优点,在免疫试剂以及药物开发等领域受到广泛的关注。文中综述了鲨源单域抗体的结构及功能特性、制备及人源化改造技术、亲和力成熟策略以及应用领域,并系统性分析了鲨源单域抗体的优缺点,最后对其发展前景进行了展望。     

β淀粉样肽单克隆抗体可变区基因的5′RACE扩增及序列分析

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′RACE法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基因序列,并克隆入pMD18-T载体。结果:重链可变区基因序列全长450bp,编码150个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长429bp,编码143个氨基酸残基。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。根据Kabat法则对A8抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(CDR)、4个框架区(FR)和信号肽。结论:通过5′RACE法得到了抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构,以及对该抗体进行人源化改造奠定了基础。     

免疫学讲座（五）：—机体的特异性免疫（下）

(3) 抗体的分子结构五种Ig分子都是由二硫键连接的四条多肽链组成。其中两条短链称为轻链(Light chainL 链)两条长链称为重链(Heavy chain H 链)。以IgG 为例,L 链由214个氨基酸组成,H 链由446个氨基酸组成。每个轻链或重链又分为两部分。多肽链氨基端(N 端),轻链的1/2与重链的1/4,其内氨基酸排列顺序随抗体种类不同而有所变化,称为可变区(Variable region V区)。多肽链羧基端(C 端),轻链的1/2与重链     

抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达

通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3.1/Hygro和pcDNA3.1( )质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞.RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Western blot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用.8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础.     

单域抗体研究进展

近年来用基因工程方法从软骨鱼和骆驼科动物中克隆到的单域抗体（single—domain antibody,sdAb）具有无轻链、单一重链可变区保留了完整的抗原结合活性的特征。这类单域抗体具有分子小、稳定性高、体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的特性,已引起生物技术研究与诊断治疗应用领域的广泛关注,取得了快速发展。综述了这类单域抗体发展历史、分子类别、结构特征、理化特征、分子演化及应用前景。     

单链抗体的研究进展

单链抗体即单链抗体可变区片段(single-chain antibody variable fragment,or ScFv)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一段10-25个氨基酸的连接肽连接而成,其分子质量小,穿透力强,特异性好,免疫原性低,在免疫学和医学方面得到了广泛应用。本文就单链抗体的结构设计、展示系统、表达和应用方面做一综述。     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

单链抗体(single chain Fv,ScFv)是由抗体重链可变区V_H和轻链可变区V_L通过一段连接肽连接而成的重组蛋白。由于其分子量小,穿透力强,免疫原性低,利于基因工程操作等优点,而具有良好的应用前景。ScFv可在大肠杆菌以包含体形式高效表达,其纯化和复性是大量制备ScFv的重要环节,我们对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)ScFv的纯化     

纳米抗体在癌症治疗中的应用

骆驼科动物的体内会产生一种缺失轻链的抗体,被称为重链抗体,又叫做nanobody。这种抗体只包含一个可变区,具有高亲和力、高稳定性、强组织穿透性、高效表达等优点,同时具有低毒性和低免疫原性等特性,适用于诊断、治疗和充当多种领域的实验研究工具。文中将主要讨论nanobody在癌症治疗中的应用,为nanobody的进一步研发提供思路。     

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。     

利用线性表达框高通量表达人源单克隆抗体

目的:建立不通过克隆步骤高通量表达来源于人单个B细胞的抗体轻、重链基因的方法。方法和结果:PCR扩增3个末端重叠的DNA片段,即1CMV启动子和编码抗体引导区序列的片段;2抗体Ig G1重链恒定区序列和牛生长激素(BGH)poly(A)信号序列,轻链Igκ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列,轻链Igλ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列;以及3抗体基因可变区序列V_H、V_κ或V_λ。3个片段通过重叠延伸PCR构建全长线性片段即线性表达框,将此来源于人单个B细胞的配对的抗体轻、重链线性表达框共转染293E细胞,72 h收集上清检测到表达的抗体。结论:构建的抗体基因线性表达框是无须克隆,快速高通量表达抗体基因进行筛选分析的策略。     

抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定

利用基因工程方法将鼠源性抗CD3抗体HIT3a的可变区和人源抗体(IgG)的完整的恒定区连接起来,构建全抗型抗CD3嵌合抗体,该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植,减少受体产生免疫排斥,提高移植器官的存活率。利用PCR方法从抗CD3 ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E上扩增抗CD₃抗体的轻链和重链可变区,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体（IgG）恒定区的表达载体中,构建抗CD3嵌合抗体IgG的轻链和重链表达载体PKN100和PG1D105,并用脂质体法共转染CHO细胞。结果证明,抗CD₃嵌合抗体的V_L和V_H与HIT3a抗体的V_L和V_H完全相符,ELISA和Western blot检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗CD₃嵌合抗体IgG的表达,表达产物能与Jurkat细胞结合,并能竞争性抑制HIT3a抗体和Jurkat细胞结合活性,³H-TdR掺入实验表明, 抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a一样,具有促进外周血单核细胞增殖的作用。我室构建的全抗型抗CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达,表达产物有较好生物活性,具有潜在的临床应用价值。     

人源抗肿瘤坏死因子—α噬菌体抗体的基因结构分析

从混合的噬菌体抗体库中筛选到了抗人ＴＮＦα的人源单克隆抗体,并对筛选到的抗体基因进行了序列测定和分析。结果表明,筛选到的４个特异性抗ＴＮＦα噬菌体抗体克隆的重链的重链基因序列相同,该重链基因长６８１ｂｐ,编码２２７个氨基酸残基,属于人免疫球蛋白第Ⅲ家族,其中１－１１９位氨基酸残基为重链可变区（ＶＨ）,１２０－２２７位为重链恒定区１（ＣＨ１）。４个噬菌体抗体克隆的轻链均缺失,因此实际上筛选到的是单重     

单链抗体的研究进展

单链抗体即单链抗体可变区片段（single-chain antibody variable fragment,or ScFv）是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一段10-25个氨基酸的连接肽连接而成,其分子质量小,穿透力强,特异性好,免疫原性低,在免疫学和医学方面得到了广泛应用。本文就单链抗体的结构设计、展示系统、表达和应用方面做一综述。     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆抗体AA98为基础,采用PCR扩增抗体AA98基因的重链可变区(V_H)和轻链(L),以重链恒定区1(C_H1)5′端12个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Lys突变为Ser,构建VH连接肽-L三结构域单链抗体。重组VH/L单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的V_H/L。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。     

单链抗体展示系统研究进展

单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)是由抗体重链可变区(variable region of heavy chain,VH)和轻链可变区(variable region of light chain,VL)通过柔性短肽连接组成的小分子,是具有完整抗原结合活性的最小功能片段,包含抗体识别及抗原结合部位。相比于其他抗体,scFv具有分子量小、穿透性强、免疫原性弱、易构建表达等优点。目前,scFv最常用的展示系统主要有噬菌体展示系统、核糖体展示系统、mRNA展示系统、酵母细胞表面展示系统和哺乳动物细胞展示系统等。近年来,随着scFv在医学、生物学、食品安全学等领域的发展,使得其在生物合成和应用研究方面备受关注。本文对近年来scFv展示系统的研究进展作一综述,以期为scFv的筛选及应用提供理论基础。