桑树内生拮抗菌的分离鉴定及其对桑断枝烂叶病的生防初探

【目的】本研究从健康桑树茎中分离筛选对桑断枝烂叶病菌具显著拮抗作用的内生细菌,为该病生物防治奠定研究基础。【方法】采用组织培养法分离桑树内生菌,抑菌圈法和平板对峙法筛选抑菌活性稳定的内生拮抗菌;根据形态学、生理生化特征检测和基于16SrDNA、gyrA和gyrB基因的系统发育分析对拮抗菌进行菌种鉴定;利用抑菌圈法测定拮抗菌株活性发酵液热稳定性,菌丝生长速率法检测活性发酵液抑菌谱;并通过观察拮抗菌对桑断枝烂叶病菌BoeremiaexiguaGXH1菌株生长及菌丝形态的影响,扩增抑菌活性物质合成关键基因,以及采用酸沉淀法提取拮抗菌株脂肽类化合物并进行高效液相色谱串联质谱分析(LC-MS),初步探究可能的抑菌机制。【结果】从健康桑树茎中共分离获得17株桑树内生细菌,并从中筛选获得一株对桑断枝烂叶病菌B.exiguaGXH1有稳定拮抗作用的桑树内生细菌NPJ13菌株。该菌株形态学、生理生化特征与芽孢杆菌属一致,基于16SrDNA、gyrA和gyrB基因序列的系统发育分析结果显示该菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)的亲缘关系最近,且处于系统发育树的最小分枝,故将NPJ13菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,命名为B. velezensis NPJ13。NPJ13菌株对灰霉病菌SWU5、核地杖菌SXSG-5、核盘菌PZ-2及烟草疫霉SWU20等12种病原真菌具有不同程度的拮抗作用,其活性发酵液具有较好的热稳定性。NPJ13菌株会导致桑断枝烂叶病菌GXH1菌丝发生扭曲、膨大、透明度增加、断裂等畸变现象;基因检测结果显示NPJ13菌株基因组中具有PKSI、NRPS、Sfp、ItuD、Srfc等5种抑菌活性物质合成关键基因,LC-MS检测结果表明菌株NPJ13脂肽类粗提物中含有表面活性素和伊枯草菌素。【结论】本研究分离筛选获得一株对桑断枝烂叶病菌具有显著拮抗作用的桑树内生细菌B. velezensis NPJ13菌株,为桑断枝烂叶病的生物防治提供了候选菌株。     

一株真菌拮抗细菌Z21的筛选与鉴定及其发酵条件优化

【背景】芽孢杆菌属的许多细菌具有抗逆性强、安全等特点,一直以来都是开发新型活性物质的研究热点。【目的】筛选对食品腐败真菌有抑制作用的细菌,将其开发为天然食品防腐剂。【方法】采用平板分离法、平板对峙法、抑制菌丝生长速率法从空气、竹子内生细菌中筛选真菌拮抗菌,通过形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析等方法对其进行鉴定,利用正交试验确定其最优生长条件。【结果】筛选到一株对6种常见霉菌均有较强抑制作用的细菌Z21。Z21与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus strain CBMB205~T)的相似性最高,且形态特征和生理生化特征与CBMB205~T菌株基本相符。Z21最佳发酵培养基配方和培养条件分别为:葡萄糖20.0 g/L、NaNO_3 20.0 g/L、MgSO_4 3.0 g/L,培养温度为32°C,培养时间为48 h。【结论】Z21为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus),对黑曲霉、康氏木霉、绿色木霉、少根根霉、易脆毛霉、赭绿青霉的生长具有较强的抑制作用且抑菌效果稳定,为广谱真菌拮抗菌。     

石斛内生甲基营养芽胞杆菌的拮抗和促生作用研究

从霍山石斛中分离内生菌,旨在获得具有广谱抗菌活性和促生作用的内生细菌。以石斛黑斑病菌为指示菌,用对峙培养法筛选具有抗菌活性的内生菌;对筛选到的具有拮抗活性的菌株进行抗菌谱和促生长潜力的测定。结果显示,从霍山石斛中分离获得22株内生细菌,其中菌株RA具有较强抑菌活性,根据16S r DNA序列分析结果鉴定RA为甲基营养芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。菌株RA可以产生IAA、嗜铁素、蛋白酶、表面活性剂和生物膜,RA对8种植物病原菌也具有较好的抑制作用,具有广谱抗菌活性;并且可以显著促进玉米幼苗的生长。RA菌株具有作为生防菌剂和生物肥料应用的良好潜力。     

反复冻融对枯草芽孢杆菌St-zn-34抑制链格孢菌活性的影响北大核心CSCD

【目的】以从冬枣分离的内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis St-zn-34)为供试菌株,明确反复冻融对菌体形态及其发酵滤液抑制枣缩果病初侵染病菌(Alternaria alternata)活性的变化。【方法】对供试菌株分批发酵后进行反复冻融,采用梯度稀释计数法、滤纸片法分别测定活菌数量和芽孢含量、发酵滤液抑菌活性,对供试菌株的形态变化进行电镜观察。【结果】发酵培养中pH值、活菌量、芽孢量及抑菌活性随发酵时间的增加均呈先上升后下降的趋势,其中发酵60 h发酵滤液抑菌活性最大,对此时的发酵液反复冻融,冻融3次枯草芽孢杆菌活菌量和发酵滤液抑菌活性依次减少,以后再冻融差异不显著(P>0.05),电镜观察发现随冻融次数增加,菌体变小,表面凹陷、扭曲,胶状物流出。抑菌谱检测发现发酵滤液对12种植物病原菌具有抑菌能力。不同温度和蛋白酶处理发酵滤液表明,低于60℃以下,抑菌活性与对照相比差异不显著;80℃以上抑菌活性随温度上升而下降,与对照相比差异显著;蛋白酶K可降低抑菌活性。【结论】反复冻融影响细菌形态并降低发酵滤液的抑菌活性。     

桑疫病病原拮抗菌的分离、鉴定及发酵条件优化北大核心CSCD

【目的】从健康桑树内生菌中分离获得对桑疫病病原菌(Pseudomonas syringae pv.mori)具有显著拮抗作用的菌株,优化其产生抑菌活性物质的发酵条件,为其生防利用奠定基础。【方法】从严格表面消毒的桑树根茎中分离内生菌,采用平板划线法纯化内生菌,用抑菌圈法筛选拮抗菌;根据菌株的形态与培养特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析对其进行鉴定。通过单因素试验和正交设计试验优化培养基组分及发酵条件。【结果】从健康桑树中分离获得内生菌77株,其中,编号为SWg2的菌株对桑疫病病原菌具有强而稳定的抑制作用。菌株SWg2的形态与培养特征、生理生化特性和泛菌属(Pantoea sp.)相符,而16S rDNA序列分析结果显示它与成团泛菌(P.agglomerans)的亲缘关系接近。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:甘油(2.00%)、硝酸铵(2.00%)、KH2PO4(0.10%)和MgSO4·7H2O(0.15%),起始pH为7.5,装瓶量20 mL/100 mL,最适培养温度为28℃,转速为170 r/min,种子液接种量为4%,摇瓶培养5 d。【结论】经鉴定,对桑疫病病原具拮抗作用的桑树内生菌SWg2为成团泛菌(P.agglomerans),命名为成团泛菌SWg2。对其发酵条件进行优化后对桑疫病病原菌显示出更强的拮抗作用。     

对叶榕榕果内生细菌分离鉴定及抑菌活性的研究

【目的】为植物-内生细菌的生态关系研究, 以及植物内生细菌资源的利用提供一定的依据。【方法】采用微生物学传统分离培养的方法从对叶榕果实中分离到内生细菌54株, 通过限制性酶切分析(ARDRA)共有16个操作分类单元(Operational taxonomic units, OTUs), 对16株代表菌株16S rDNA序列系统发育分析。【结果】16个菌株都找到了与其相似性最高的菌株, 相似性达到95%?100%。其中6株为芽孢杆菌Bacillus属, 为对叶榕果实内生细菌优势菌属; 3株为Staphylococcus属, 2株为Pseudomonas属, 1株为Serrata属, 1株为非培养细菌的同源菌, 1株为Kocuria属, 1株为Delftia属, 还有1株为Acinetobacter属。【结论】这16株内生菌在系统发育树中明显聚为两大支; 在参与抑菌试验的14株内生菌中, 有13株对受试菌有不同程度的拮抗作用。尤其是其中的芽孢菌属的Swx15和不动杆菌属的Swx25菌株, 抑菌作用较强, 且有较广的抑菌谱性。     

甲基营养型芽孢杆菌拮抗玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌及环脂肽分析

【目的】探究甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)对植物病原菌玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis Tehon et Daniels)、链格菌(Alternaria alternate)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的拮抗作用并鉴定抗菌物质,为其病害防治提供优良生防菌。【方法】平板对峙法初筛和杯碟法筛选拮抗菌株;微生物形态学和16S rRNA基因鉴定拮抗菌株;薄层色谱(TLC)和编码基因分析鉴定抗菌物质;玉米田间生防试验评估拮抗菌对3种病原菌的防治效果。【结果】筛选到一株能够明显拮抗玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌的甲基营养型芽孢杆菌B-1841,抑制率分别为65.95%、71.04%和46.69%,抑菌物质为伊枯草菌素类脂肽。玉米田间生防试验表明,菌株B-1841对玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌感染的玉米病害均有防治效果,相对防效分别为60.25%、69.89%和45.21%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌B-1841对玉蜀黍尾孢菌、链格菌和灰葡萄孢菌引起的病害有防治作用,在农作物真菌病害防治方面具有潜在应用价值。     

沙棘根瘤内生细菌中抑菌促生菌株的筛选和鉴定

【背景】植物内生细菌可产生具有抑菌和促生活性的物质,既能抑制植物病原菌对寄主植物的侵染,也能促进植物的生长。沙棘根瘤内生细菌是根瘤内除共生固氮的弗兰克氏菌外,与沙棘共生的一大类微生物。研究具有抑菌和促生活性的植物内生菌,可为微生物菌肥的研究提供理论基础。【目的】筛选具有优良抑菌和促生活性的沙棘根瘤内生细菌,初步研究其抑菌和促生活性,并对菌株进行鉴定。【方法】采用双层琼脂法、琼脂扩散法、双层平板对峙法、牛津杯法进行沙棘根瘤拮抗性内生细菌的筛选。选取抑菌活性较高的内生细菌,分别采用Salkowski比色法、ChromeAzurolS(CAS)平板检测法和钼锑抗比色法进行产吲哚乙酸、铁载体及溶磷能力的测定。采用发酵液灌根法测定沙棘根瘤内生细菌SR308对黄瓜促生作用的盆栽效果。通过形态和培养特征、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析法对菌株TT201和SR308进行鉴定。【结果】从131株沙棘根瘤内生细菌中筛选出9株具有较强抑菌活性的内生细菌,其中菌株TT201抑菌性最佳、抑菌谱广;菌株SR308的促生活性最好,其发酵液对黄瓜的生长具有较强的促进作用。对具有较强抑菌和促生活性的菌株TT201和SR308进行鉴定的结果表明,菌株TT201为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus),菌株SR308为蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)。【结论】获得2株具有优良抑菌和促生活性的沙棘根瘤内生细菌,为进一步开发微生物农药及菌肥提供了资源。     

温郁金内生拮抗细菌B-11的分离及其抑菌活性

【背景】植物内生菌广泛分布在自然界中,具有巨大的潜在开发与应用价值。【目的】对温郁金内生细菌进行分离鉴定,并从中筛选出具有生防潜能的菌株。【方法】采用常规组织分离法对温郁金根茎内生细菌进行分离并利用16S rRNA基因序列分析进行初步鉴定;采用平板对峙法以铁皮石斛炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)为供试菌株对温郁金内生细菌进行拮抗菌的筛选;通过形态学鉴定、生理生化鉴定以及16S rRNA基因序列分析,确定拮抗菌株B-11的分类地位;以6个不同属的植物病原真菌为供试菌株对拮抗菌株B-11的抑菌谱进行测定,并研究其对病原菌菌丝的影响;利用特异性平板和MALDI-TOF-MS检测技术对拮抗菌株B-11产生的抑菌物质进行检测;采用离体叶片接种法研究拮抗菌株B-11对铁皮石斛炭疽病菌的防治效果。【结果】从温郁金根茎中分离得到25株内生细菌菌株,这些细菌菌株分属于12个属,其中芽孢杆菌属为优势菌属,占分离菌株的28%;通过初筛获得8株对C.gloeosporioides有抑菌活性的菌株,其中菌株B-11的抑菌活性最强,经鉴定该菌为贝莱斯芽孢杆菌(Baclliusvelezensis);抑菌谱测定发现菌株B-11能够对供试的属于不同属的6种植物病原真菌的菌丝生长具有抑制作用,显微观察发现经对峙培养6 d后这6种病原菌的菌丝体出现畸形膨大、分枝增多等现象;特异性平板检测结果表明拮抗菌株B-11能够产生蛋白酶、β-葡聚糖酶和嗜铁素,但不产生几丁质酶;MALDI-TOF-MS检测结果表明拮抗菌株B-11能够产生伊枯草素、丰源素和表面活性素3种脂肽类抗生素,其中伊枯草素的产量最高;离体叶片接种实验表明,拮抗菌B-11的离心去菌发酵液对铁皮石斛炭疽病的防治效率可达64%。【结论】温郁金根茎含有丰富的内生细菌资源,其内生细菌菌株B-11有潜力作为开发抗真菌代谢物和新药物的重要微生物资源。     

油樟内生芽孢细菌的系统发育多样性

摘要：【目的】为了解油樟产芽孢内生细菌的多样性。【方法】采用改良的牛肉膏琼脂培养基分离、去除冗余及芽孢染色,测定所得产芽孢内生细菌的16S rRNA基因,进行系统发育分析。【结果】40株产芽孢内生细菌数量占分离得到的内生细菌总数的38.1％,其中根、茎、叶中分别分离得到24株、7株和9株。16S rRNA基因序列系统发育分析结果表明,35株菌可能分属于Bacillus、Lysinibacillus、Paenibacillus属的16个种,还有5株菌的序列与数据库中典型菌株序列相似性低于97％,代表着潜在新类群的存在。【结论】从油樟3个部位分离出的产芽孢内生细菌存在明显的系统发育多样性,而且3个部位分离出的产芽孢内生细菌区系既呈现出一定程度的细菌区系相似性,又表现出器官细菌区系的特异性。     

蚕用桑不同品种叶表皮形态和结构的比较研究Ⅰ

运用光学显微镜和扫描电镜对11种蚕用桑品种的叶表皮形态和结构进行观察研究。结果表明,品种间在表皮、叶肉和叶脉上的构造基本相似;主要差别在于气孔密度、上表皮细胞中的钟乳体细胞数目及叶肉中晶体的分布。基于表皮形态学特征的数量分析,结果表明,11个品种可分为6大类,这与传统分类结果基本一致。     

桑椹挥发性成分的分析研究

对广东桑桑椹石油醚和乙酸乙酯提取物中的化学成分进行GC-MS分析。与WILEY谱库的标样质谱图进行比较,鉴定出21种化学成分。     

桑椹中黄酮类物质的大孔树脂纯化工艺

以桑椹中黄酮类物质的吸附量和解吸率为指标,对比分析HZ-801、HZ-816、HZ-818等12种大孔吸附树脂对桑椹提取液的分离纯化效果,优选出最佳树脂HZ-801并通过对上样液pH、上样液质量浓度、上样量、吸附流速、洗脱剂质量浓度、洗脱剂用量、洗脱流速等影响因素的考察,确定最优工艺:吸附阶段上样液pH=4,上样液质量浓度0.45mg/mL,上样量420mL,吸附流速120mL/h,动态吸附量(干树脂)25.34mg/g,吸附率84.25%;洗脱阶段的洗脱剂体积分数为60%乙醇,洗脱剂用量270mL,洗脱流速120mL/h。此优化工艺条件下的洗脱率为85.78%,总黄酮纯度从23.64%提高到82.36%。     

桑树花粉愈伤组织的诱导与花粉细胞学研究

讨论影响桑树花粉愈伤组织诱导频率的问题 ,描述花粉细胞早期发育和愈伤组织的分化过程     

桑椹菌核病菌多样性调查

2003～2006年对本地果桑上桑椹菌核病病菌的多样性进行了调查,结果发现有5种核盘菌：Ciboria comnculoides,Ciboria shiraiana,Scleromitrula sp．,Scleromitrula rubicola和Synciboria ningpoensis。其中Ciboria shiraiana和Scleromitrula sp．的出现频率分别高达49．7％和41．9％。Scleromitrula sp．和Synciboria ningpoensis是2种新类型。Scleromitrula sp．的子囊盘高2．5～4．1mm,宽1．4～3．0mm,子囊孢子大小7．7～11．1×3．4～4．1μm,纵向有一明显内凹的特征。Synciboria ningpoensis的子实体冠状,2．3～2．5×3．0—3．8mm,由多个无柄的直径512～704μm微子囊盘组成。     

桑叶提取物抑菌作用的研究

研究了桑叶水煎剂对常见微生物的抑菌作用,以及在不同pH值条件下的抑菌效果.结果表明:提取液对霉菌的生长没有明显的抑制作用;对供试细菌有效,其中对微球菌的抑制最强,其次为沙门氏菌和大肠杆菌,对枯草芽孢杆菌的作用较弱.抑菌效果随着桑叶水煎剂浓度的增加而加强.在酸性条件下,桑叶水煎剂的抑菌作用都有不同程度的增加,但效果均不如0.05%苯甲酸钠.