Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra（Stimulated by Retinoic Acid）基因。从鼠源分离得到的Stra8 基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8 基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8 基因的启动子序列（1.4kb）。将Stra8 基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8 基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8 的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8 和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra(Stimulated by Retinoic Acid)基因。从鼠源分离得到的Stra8基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8基因的启动子序列(1.4kb)。将Stra8基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

MiR-34c在奶山羊雄性生殖干细胞增殖分化过程中的作用

microRNA (miRNA)在奶山羊雄性生殖细胞和精子发生过程有重要的调控功能。为研究miR-34c对雄性生殖干细胞增殖与分化中的作用,本文利用视黄酸效应基因8（Stra8）在雄性生殖细胞中随年龄增长,以其表达量上调的表达特征为指针,使用实时定量PCR技术筛选分析miRNAs。结果发现,miR-34c与Stra8的表达规律基本一致。在无精症奶山羊的睾丸组织中,发现miR-34c在无精症奶山羊睾丸组织中表达缺失。利用miR-34c模拟物及抑制剂转染奶山羊雄性生殖干细胞,体外转染miR-34c模拟物及其抑制剂,发现miR-34c能够下调Rarg、Stra8与c-Myc基因的表达,减缓奶山羊雄性生殖干细胞的增殖。结果提示,miR-34c可能具有调控奶山羊雄性生殖干细胞的减数分裂的作用,同时抑制其增殖。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

腺病毒载体介导PDX-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究PDX-1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥,构建了含PDX-1基因的重组腺病毒载体. 酶切PDX-1基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV.用电穿孔法使穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDX-1与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组.利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒.分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞.用重组腺病毒感染间充质干细胞.用荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光染色等方法检测PDX-1、胰岛素基因及蛋白质的表达,用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况.结果表明:通过测序、PCR、酶切等鉴定PDX-1基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组.重组腺病毒滴度为6.3×10⁷ PFU/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞,经RT-PCR、免疫荧光染色证实转染pAd-PDX-1后培养7天的细胞中有PDX-1及胰岛素基因的表达.这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为(15.21±3.50) mIU/L.     

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞（MSCs）是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子（Bdnf）基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区（CDS）片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES₂-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs（rMSCs）后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10⁷TU/mL, PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞（MSCs）是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子（Bdnf）基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区（CDS）片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES₂-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs（rMSCs）后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10⁷TU/mL, PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

Figla基因过表达促进小鼠胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化

生殖系a因子(Figla）是最早表达的生殖细胞特异性转录因子之一,对卵泡的发育、Zp基因的表达和透明带的形成具有调节作用. Figla基因异常会引起卵巢早衰的发生. 本研究通过 PCR自小鼠基因组中扩增出Figla基因,将其克隆到真核报告载体pDsRed1 N1,构建了携带609 bp 的Figla重组载体pDsRed1 N1 Figla. 用该载体转染小鼠胚胎干细胞（mESCs）系J1、小鼠成纤维细胞系NIH 3T3、小鼠畸胎瘤细胞P19和小鼠精原细胞系GC1,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)在细胞中的表达,同时检测转染细胞中Figla基因及其它生殖细胞特异性基因的表达. 结果显示,转染2 d,mESCs内Figla总表达量明显增加,且内源性表达量亦有所提高,即转入的外源性Figla基因可以促进内源性Figla的启动和表达. 免疫荧光染色显示,表达RFP 的细胞同时表达生殖特异性基因Vasa,减数分裂特异性基因Stra8、Scp3及卵母细胞标志基因Zp3. 通过QRT PCR检测发现,在转染3 d的细胞中,Vasa、Scp3和Zp1的表达较对照组均有明显上调,而Oct4和Stra8的表达量下降. 研究表明,Figla基因对生殖特异性基因的表达具有调控作用,可以激活雌性生殖基因表达,为更清楚地了解Figla基因在生殖细胞生长发育过程中的调控机制,以及发现该基因在生殖细胞中的新功能奠定了基础.     

山羊生殖细胞特异报告载体pVASA-EGFP的构建及表达

为监测成体干细胞向生殖细胞分化的过程,分析生殖细胞特异性DEAD-box家族ATP依赖RNA解旋酶vasa在不同日龄山羊睾丸组织中的表达情况并构建山羊生殖细胞特异性报告载体p VASA-EGFP。通过免疫荧光及RT-PCR法监测vasa的表达情况,利用分子技术构建报告载体p VASA-EGFP,脂质体法转染山羊骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),经过视黄酸(Retinoic acid,RA)诱导后,观察绿色荧光蛋白表达情况以鉴定该报告载体的有效性。免疫荧光结果显示,Vasa在性成熟不同阶段的山羊睾丸组织中均有表达,RT-PCR结果表明vasa基因在3月龄、10月龄山羊睾丸组织中显著高于10日龄组。测序及酶切鉴定结果表明,扩增的vasa基因启动子片段成功连至N1载体,转染BMSCs后经4 d的RA诱导,发现有绿色荧光蛋白表达,表明成功构建了山羊vasa基因启动子调控的报告载体p VASA-EGFP。以上结果表明,vasa基因在不同日龄山羊睾丸组织中均有表达,所构建的山羊生殖细胞特异性报告载体p VASA-EGFP具有示踪山羊成体干细胞向生殖细胞分化过程的能力,为下一步监测山羊BMSCs向生殖细胞分化的过程提供了鉴定和筛选方法。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.