灵芝子实体原基双向电泳和总蛋白质提取方法的建立

比较了Tris-饱和酚法和三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法对灵芝子实体原基总蛋白质的提取效果。用Image Master 2D Platinum6.0软件分析两种方法所提蛋白质的双向电泳图谱,分别得到565和273个蛋白质点;(TCA)/丙酮沉淀法在碱性端低分子量区域有些蛋白质斑点存在拖尾现象,Tris-饱和酚法能有效去除样品中的盐分,使蛋白质的聚焦效果更好,蛋白点数增加。Tris-饱和酚法可做为灵芝子实体原基总蛋白质的提取方法并为其他药用真菌总蛋白质的提取提供参考,同时为本实验室后续研究灵芝双向性固体发酵雷公藤的蛋白差异表达奠定了基础。     

适用于双向电泳的杨树叶片蛋白质提取方法的研究

为了获得分离效果好、清晰度高的杨树叶片蛋白质双向电泳图像,本研究以小黑杨、毛果杨和84K杨叶片为材料,采用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法和Tris-三氯乙酸法提取杨树叶片总蛋白质,分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向凝胶电泳对蛋白质进行分离,应用Image Master 2D Platinum 6.0软件对这3种蛋白质提取方法得到的双向电泳凝胶进行分析。结果表明:Tris-三氯乙酸法最适用于双向电泳的杨树叶片蛋白质的提取。利用Tris-三氯乙酸法提取蛋白质得到的鲜样中总蛋白质平均含量为949.46μg·g-1,得到的蛋白质点平均数量为567个,所得到的双向电泳凝胶图谱分离效果好、清晰度高。     

适于小麦叶片蛋白质组分析的样品提取方法研究

以‘铭贤169'小麦苗期叶片为材料,分别采用传统的TCA/丙酮沉淀法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法以及改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取叶片总蛋白,进行双向电泳分离和胶体考染,以建立适用于小麦蛋白质组分析的样品制备方法.结果表明:TCA/丙酮沉淀法较酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法获得的蛋白杂质较少,在二维电泳图谱中的蛋白点较酚抽提-甲醇/醋酸铵沉淀法提取的蛋白点清晰且多.相比于以上2种提取蛋白样品方法,改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取的小麦叶片蛋白杂质少、二维电泳图谱上的点明显增多、分辨率较高.所选小麦的代表性蛋白点能获得成功鉴定.该方法可推广应用于水稻叶片蛋白质组分析的样品提取.     

蒙古沙冬青叶蛋白质双向电泳体系的建立和优化

开展蒙古沙冬青叶组织的蛋白质组学研究,需要建立和优化叶的蛋白质组双向电泳体系。本研究以蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)叶片为材料,比较了不同总蛋白提取方法(TCA-丙酮法和Tris-饱和酚法)、不同染色方法(考马斯亮蓝染色和硝酸银染色)和不同蛋白质上样量对双向凝胶电泳蛋白质得率和等电聚焦效果的影响。结果显示,采用TCA-丙酮法提取蒙古沙冬青叶片总蛋白,蛋白质上样量500μg,以硝酸银染色SDS-PAGE胶,双向电泳的分辨率最高,图谱清晰。该方法的建立为开展蒙古沙冬青叶片蛋白质组定量和定性分析奠定了基础。     

苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立

为了建立适于苹果属植物树皮组织总蛋白提取的技术方法, 以8年生华月苹果(Malus domestica)树枝条为试材, 通过比较不同提取方法(TCA-丙酮沉淀法(A)、甲醇/醋酸铵沉淀法(B)和改良的Tris-酚抽提方法(C))并优化提取条件, 确立了最适提取及分离方法为改良的Tris-酚抽提方法。在2-DE分离时, 该方法所获得的样品图谱中蛋白点总数为993个, 明显多于TCA-丙酮沉淀(418个)和甲醇醋酸铵沉淀(674个)方法, 并且与其它两种方法相比, 该方法获得的图谱背景更清晰, 蛋白点聚焦效果更好。此外, 经过3个梯度上样量的图谱分离效果比较, 确定了800 μg为本研究中2-DE分析的理想上样量。另外, 为了验证该提取及分离方法的可行性, 进一步对蛋白质表达谱中的部分蛋白点进行了质谱分析, 且这些蛋白点均得到了成功鉴定。该研究通过优化总蛋白提取方法及样品上样量等条件, 获得了理想的双向电泳分离图谱, 为苹果属植物树皮组织材料的蛋白质组学研究奠定了基础。     

猪卵泡液样品制备方法对双向电泳图谱的影响

比较不同的蛋白制备方法,寻找适合猪卵泡液的双向电泳样品制备方法,提高2-DE图谱的分辨率和重复性。利用ProteoExtract Albumin/IgG Remove Kit去除卵泡液中的高峰度蛋白;然后分别用丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和超滤法进行样品浓缩,比较分析对2-DE图谱的影响。结果表明,TCA/丙酮沉淀法制备的蛋白样品获得的电泳图谱质量较好,蛋白斑点数目较多,斑点较清晰、圆滑,分辨率较高,重复性较好。TCA-丙酮沉淀法更适合于制备猪卵泡液的双向电泳蛋白样品,为进一步对猪卵泡液2-DE图谱进行分析、鉴定及寻找生物标记物提供了保证。     

一种适合稻水象甲双向电泳的蛋白质提取方法

【背景】蛋白样品制备是2-DE蛋白组学研究的关键步骤,无杂质、高纯度的蛋白样品是获得良好的2-DE结果的基础。选择合适于昆虫蛋白组学研究的常规蛋白提取方法是2-DE研究的前提。【方法】通过饱和酚法和TCA-丙酮法提取稻水象甲成虫总蛋白,比较2种方法的优缺点,以回避昆虫组织蛋白提取时可能出现的问题。【结果】TCA-丙酮法的蛋白质产率(14.55μg·mg-1)显著高于饱和酚法(9.30μg·mg-1),2种方法获得的SDS-PAGE条带结果相近,且高丰度表达蛋白在TCA-丙酮中更高表达;饱和酚的2-DE图谱蛋白点清晰,TCA-丙酮法2-DE图谱蛋白点规则但背景模糊,出现多条横纹。【结论与意义】饱和酚法适合稻水象甲成虫蛋白组学的研究。这2种方法也能适用于其他昆虫,但不同的昆虫体内有不同的干扰组分来干扰蛋白质的提取,所以获得的蛋白纯度及提取得率可能并不一样。试验结果说明了2种蛋白提取方法对2-DE研究的影响,并为稻水象甲成虫的蛋白组学研究提供了一定的参考依据。     

小菜蛾蛋白质提取方法的比较

建立适用于小菜蛾蛋白质组学研究的样品前处理方法。应用SDS-PAGE电泳比较分析了TCA-丙酮沉淀,Tris-饱和酚抽提,RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent直接裂解4种方法对小菜蛾幼虫总蛋白的抽提质量。结果显示:4种方法对小菜蛾全蛋白的提取率差异比较显著,其中RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent两种直接裂解法蛋白提取率最高,分别为52.06 mg/g和46.16 mg/g;TCA-丙酮沉淀法提取率适中,为34.58 mg/g;Tris-饱和酚抽提法提取率最低,为27.39 mg/g。SDS-PAGE电泳分析表明,Tris-饱和酚抽提法蛋白谱条带分辨率最高,蛋白条带最多,为32条,在17.0 k Da-245 k Da的范围内分布均匀;TCA-丙酮沉淀法蛋白谱带数目为30条,条带清晰,分辨率较高,但缺失部分蛋白;RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent两种直接裂解法蛋白谱条带数目较少,小分子蛋白条带丢失或不明显。根据蛋白提取率和条带的数量综合分析,TCA-丙酮沉淀法适用于小菜蛾蛋白质组学的样品前处理。     

用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白样品制备方法的比较

为建立适用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白的制备方法,分别比较了直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法,Trizol法和2-D clean up kit法对奶牛乳清蛋白提取效率和双向凝胶电泳图谱的影响.用2-D Quant Kit试剂盒测定蛋白浓度,分别用十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向凝胶电泳进行奶牛乳清蛋白的分离.蛋白定量结果表明,2-D clean up kit法产率最高,直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法次之,trizol法产率最低;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,2- D clean up kit法提取的蛋白质量最高;双向电泳图谱分析表明,2-D clean up kit法得到的蛋白图谱与另外3种方法相比,检测到的蛋白点最多,图谱背景清晰,分辨率最高.结果提示,2-D clean-up法相对最适合于双向凝胶电泳分析奶牛乳清蛋白样品的制备,尤其对一些低丰度高分子量蛋白的分离效果较为明显.     

砂藓总蛋白质提取方法的选取及双向电泳体系的建立

为进行砂藓(Racomitrium canescens)蛋白质组学的双向电泳工作,首要前提是获得质量较好的砂藓总蛋白质,并建立一套完整高效的适用于砂藓的双向电泳体系。本研究以砂藓为研究对象,比较了Tris-酚抽提法、TCA-丙酮法和试剂盒法3种蛋白质提取方法获得砂藓总蛋白质的浓度和完整性,并对砂藓中蛋白质双向电泳的运行条件进行了优化和比较。结果表明:在3种砂藓总蛋白质提取方法中,Tris-酚抽提法获得的砂藓总蛋白质浓度最高,SDS-PAGE电泳结果中条带清晰且较完整,双向电泳后获得的蛋白质点最多,是3种方法中提取砂藓蛋白质浓度最高完整性最好的方法;基于Tris-酚抽提法的基础上进一步对砂藓总蛋白质双向电泳体系进行优化,结果显示:利用pH值范围为pH 4～7的IPG胶条,蛋白质上样量为1 000μg的条件下,获得的砂藓蛋白质双向电泳图谱蛋白质点最多,图谱中可分辨的蛋白质点共(872±15)个,且低丰度蛋白质点清晰。本研究筛选出的方法获得了蛋白质点分布均匀、背景清晰、分辨率高、质量较高的双向电泳图像,建立了砂藓蛋白质组学研究体系的较好方法。本研究结果为砂藓蛋白质组学研究提供了良好基础。