慢性缺氧大鼠肺内（肺血管壁）细胞增殖,凋亡及c—myc,p53 …

目的和方法：应用免疫组织化学,原位末端标记技术及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等方法检测慢性缺氧大鼠肺内特别是肺血管壁细胞增殖,凋亡及相关基因ｃ－ｍｙｃ,ｐ５３表达。结果 正常及慢性缺氧大鼠肺内检出一定比率的增殖,凋亡阳性细胞,两类细胞在肺内呈不均匀散在分布,在缺氧大鼠肺内,增殖阳性细胞绝大部分是肺小血管壁细胞,凋亡性染色细胞在肺小血管壁上较对照组少见。缺氧１,２周组大鼠肺内细胞增殖指数显著增高而凋亡指数显     

慢性缺氧大鼠肺内(肺血管壁)细胞增殖、凋亡及c-myc、p53基因表达研究

目的和方法：应用免疫组织化学、原位末端标记技术及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等方法检测慢性缺氧大鼠肺内特别是肺血管壁细胞增殖、凋亡及相关基因ｃｍｙｃ、ｐ５３表达。结果：正常及慢性缺氧大鼠肺内检出一定比率的增殖、凋亡阳性细胞,两类细胞在肺内呈不均匀散在分布。在缺氧大鼠肺内,增殖阳性细胞绝大部分是肺小血管壁细胞,凋亡性染色细胞在肺小血管壁上较对照组少见。缺氧１、２周组大鼠肺内细胞增殖指数显著增高而凋亡指数显著减少,细胞增殖凋亡比值分别约为对照组３与３５倍。ｃｍｙｃ及ｐ５３是细胞增殖、凋亡密切相关的两种癌（抑癌）基因,前者在缺氧大鼠肺内表达显著增加,而后者（野生型）表达显著减少。结论：可能由于ｃｍｙｃ及ｐ５３基因异常表达所致的细胞增殖、凋亡失衡参与了慢性缺氧性肺血管结构改建的调节。     

人胎儿胸腺内bc1－2基因表达与分布

采用免疫酶组织化学与地高辛标记的单链ｃＤＮＡ探针原位杂交技术,研究了抗凋亡基因ｂｃｌ－２在人胎儿胸腺组织中的表达与分布。结果ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ及其蛋白均优势定位于髓质区。提示胸腺中ｂｃｌ－２基因表达调控发生在转录水平;ｂｃｌ－２基因介导的细胞凋亡状态可能参与Ｔ淋巴细胞的成熟过程。     

bcl-2癌基因蛋白在鼻咽癌以及单克隆癌细胞裸鼠体内连续传代中的表达

用免疫组织化学Ｓ－Ｐ方法,检测了４０例低分化鼻咽癌、３０例鼻咽癌克隆细胞裸鼠移植瘤、１０例慢性鼻咽炎及８例人胚鼻咽上皮组织石蜡包埋切片中抗凋亡基因ｂｃｌ－２癌蛋白的表达;并进一步检测了鼻咽癌克隆株在裸鼠体内演进中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达以及与淋巴结转移之间的关系。结果表明：鼻咽癌及其裸鼠移植瘤组织中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达率分别为６２．５％和７０％,慢性鼻咽炎中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达率为１０％,人胚鼻咽上皮组织中不表达ｂｃｌ－２癌蛋白,鼻咽癌及其裸鼠移植瘤组织中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达率明显高于慢性鼻咽炎组织中（Ｐ＜０．０１）;鼻咽癌克隆株演进中癌细胞ｂｃｌ－２癌蛋白的表达不断升高,其淋巴结转移率亦不断升高。提示：抗凋亡基因ｂｃｌ－２癌蛋白的表达可能和鼻咽癌的发生、演进及转移能力密切相关     

重组RA—538及反义c—myc腺病毒对人胃癌,食管癌和bcl—2高表达细胞系的作用

本课题研究ＲＡ５３８、反义c-ymc重组腺病毒对人胃癌（ＳＧＣ７９０１）、食管癌（Ｅ Ｃ１０９、ＥＣ８７１２）、正常人胚肺２ＢＳ（２ＢＳ）及ｂｃｌ－２高表达细胞第的体仙外生物学作用及其分子机制。结果显示Ａｄ－ＲＡ５３８及Ａｄ－ＡＳｃ－ｍｙｃ对ＳＧＣ７９０１细胞体内外均具有明显的生长抑制及凋亡诱导作用,并能抑制其ｃ－ｍｙｃ、ｂｃｌ－２、ｃｙｃｌｉｎＤ１基因的表达及刺激ｂａｘ基因的表达。对ＥＣ１０９、ＥＣ８     

细胞凋亡过程中bcl-2基因的甲基化

为探讨凋亡过程中,ｂｃｌ－２基因下调与该基因甲基化状态的关系,用５－氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）诱导小鼠成纤维细胞ＮＣ３Ｈ１０,ＴＣ３Ｈ１０及人乳腺癌细胞ＭＣＦ－７的凋亡,分别检测了这三种细胞凋亡过程中ｂｃｌ－２的表达变化,与其调控区及编码区的甲基化状况．我们曾观察到５－Ｆｕ作用２４～４８ｈ出现细胞存活率下降,ＤＮＡ梯状断裂及细胞周期凋亡峰显现等典型凋亡现象．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示,在５－Ｆｕ作用１２ｈ时ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ水平已明显降低．由此,我们用小鼠ｂｃｌ－２（ｍｂｃｌ－２）及人ｂｃｌ－２（ｈｂｃｌ－２）基因调控区ＰＣＲ扩增片段及ｂｃｌ－２编码区（ｃＤＮＡ）片段作为探针,与５－Ｆｕ作用１２ｈ的细胞ＤＮＡ的ＭｓｐⅠ／ＨｐａⅡ酶切产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,以未作用的细胞ＤＮＡ同样酶切杂交为对照．通过杂交带谱的变化,分析ｂｃｌ－２基因的甲基化状况．结果显示：ｍｂｃｌ－２及ｈｂｃｌ－２在５－Ｆｕ作用１２ｈ后调控区甲基化水平增高,但其编码区甲基化状态皆未出现可检出的变化．上述结果提示：ｂｃｌ－２基因调控区甲基化水平升高可能与该基因下调有关     

急性白血病细胞中抗凋亡蛋白bcl－2及其mRNA的表达

采用免疫组织化学与原位杂交方法检测了２５例急性髓系或淋巴系白血病骨髓活检组织及６种白血病细胞株中ｂｃｌ－２蛋白及其ｍＲＮＡ水平。结果２１例白血病标本中存在ｂｃｌ－２蛋白及其ｍＲＮＡ的一致性高表达;５种白血病细胞株（ＣＥＭ、Ｒａｊｉ、ＨＬ－６０、Ｕ９３７及Ｋ５６２）均能表达一定水平的ｂｃｌ－２蛋白及其ｍＲＮＡ（Ｍｏｌｔ－４例外）。提示ｂｃｌ－２基因的功能状态与淋巴造血系统肿瘤密切相关。     

血管活性肠肽、表皮生长因子上调支气管上皮细胞bcl-2基因表达

为探索肺内调节血管活性肠肽（ＶＩＰ）和表皮生长因子（ＥＧＦ）抗氧化保护的基因机制,用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ杂交等方法检测的代培养的兔支气管上皮（ＢＥＣ）内ｂｃｌ－２和ｃ－ｍｙｃ基因的表达中加入去甲肾上腺素观察ＶＩＰ、ＥＧＦ热应激对这两个基因表达的影响。结果显示：（１）基基础情况下ＢＥＣ内有ｂｃｌ－２和ｃ－ｍｙｃ基因的低水平表达;（２）ＥＧＦ和ＶＩＰ明显增强ｂｃ     

脑缺血再灌流大鼠海马hsp70及bcl—2基因的表达

为进一步了解中枢神经系统中选择性易损伤的分子机制,采用大鼠短暂前脑缺血再灌流损伤动物模型,应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、原位杂交及免疫组织化学方法,检测了ｈｓｐ７０及ｂｃｌ－２基因的表达及其组织学分布。发现易损伤的海马ＣＡ１区锥体细胞出现ｈｓｐ７０基因的诱导表达,ＢＣＬ－２蛋白合成受抑制;而耐受缺血的海马ＣＡ３区锥体细胞则明显地持续表达ＢＣＬ－２蛋白,却未见明显的ｈｓｐ７０基因表达。因此提示,ｈｓｐ７０基因的表达是神经元缺血的应激指征,也可能对神经元有保护作用;ＢＣＬ－２蛋白对神经元有保护作用     

小鼠成纤维细胞凋亡过程中P53与bcl-2表达的时序性

为探讨细胞凋亡过程中,ｂｃｌ－２与Ｐ５３,这两种凋亡关键性基因的相互关系,用５－氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）诱导小鼠正常与恶性转化的成纤维细胞的凋亡,观察了这两种基因在凋亡过程中表达变化的时序．经流式细胞计检测,这两种细胞在５－Ｆｕ作用２４ｈ均出现了凋亡峰,细胞存活率随之下降,ＤＮＡ电泳显现梯状断裂．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示,在５－Ｆｕ作用６ｈ后两种细胞Ｐ５３ｍＲＮＡ水平已明显增高,而ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ水平则在作用１２ｈ方明显降低．Ｐ５３上调与ｂｃｌ－２下调的明显时序性,说明Ｐ５３具备作为ｂｃｌ－２基因负调控转录因子的条件．由此,为进一步了解凋亡过程的ｂｃｌ－２基因下调机理提供了线索     

SLE患者PBMC凋亡状态及相关基因表达的研究

探讨外周血单个核细胞(PBMC)凋亡及其基因调控在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)发病机制中的作用.用流式细胞仪(FCM)检测PBMC凋亡百分率及T细胞亚群的凋亡状态;用RT-PCR检测PBMC bcl-2和bax的mRNA表达;用FCM检测凋亡相关基因bcl-2,bax,fas,p53和c-myc的蛋白表达.结果显示,SLE患者PBMC凋亡百分率明显高于正常人,且活动期患者高于非活动期患者.SLE活动期患者CD4+,CD8+T细胞数明显低于正常人;非活动期患者CD8+T细胞数明显低于正常人,而CD4+T细胞数与正常人比较无统计学差异;SLE患者PBMC bcl-2和bax mRNA表达与正常人比较无统计学差异;SLE患者PBMC bcl-2,bax和fas蛋白表达明显高于正常人,p53和c-myc蛋白表达在各组之间无统计学差异.SLE患者PBMC凋亡百分率增高、外周血T细胞亚群的异常及bcl-2,bax和fas蛋白表达增高,在SLE发病机制中可能起了一定的作用.     

Deregulation of apoptosis mediators' p53 and bcl2 in lung tissue of COPD patients

Abnormal apoptotic events in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) subvert cellular homeostasis and may play a primary role in its pathogenesis. However, studies in human subjects are limited.p53 and bcl2 protein expression was measured by western blot on lung tissue specimens from 43 subjects (23 COPD smokers and 20 non-COPD smokers), using beta-actin as internal control. Additionally, p53 and bcl2 expression patterns were evaluated by immunohistochemistry in formalin-fixed, paraffin-embedded lung tissue sections from the same individuals.Western blot analysis showed statistically significant increased p53 protein levels in COPD smokers in comparison with non-COPD smokers (p = 0.038), while bcl2 protein levels were not statistically different between the two groups. Lung immunohistochemistry showed increased ratio of positive p53-stained type II pneumocytes/total type II pneumocytes in COPD smokers compared to non-COPD smokers (p = 0.01), whereas the p53 staining ratio in alveolar macrophages and in lymphocyte-like cells did not differ statistically between the two groups. On the other hand, bcl2 expression did not differ between the two groups in all three cell types.The increased expression of pro-apoptotic p53 in type II pneumocytes of COPD patients not counterbalanced by the anti-apoptotic bcl2 could reflect increased apoptosis in the alveolar epithelium of COPD patients. Our results confirm previous experiments and support the hypothesis of a disturbance in the balance between the pro- and anti-apoptotic mediators in COPD.     

低O2高CO2对肺动脉环氧酶-2基因表达的影响

目的：研究慢性低氧高二氧化碳对大鼠肺动脉环氧酶-2（COX-2）基因表达的影响。方法：将SD大鼠分为正常对照组（A组）,4周低O2高CO2组（B组）。采用免疫组化、原位杂交、图像分析等方法,观察两组大鼠肺动脉平均压（mPAP）、颈动脉平均压（mCAP）、右心室／（左心室＋室间隔）重量比[RV／（LV＋S）]、肺细小动脉显微结构及肺细小动脉COX-2活性及基因表达变化。结果：①B组mPAP、Rv／（LV＋S）显著高于A组（P〈0,01）。两组间mCAP比较差异无显著性（P〉0．05）。②光镜下正常对照组大鼠肺细小动脉内弹力板自然弯曲,平滑肌层未见明显增厚,管壁均匀一致,而低O2高CO2组内弹力板扭曲,中膜平滑肌细胞增生,管腔明显狭窄。③免疫组化、原位杂交发现B组肺细小动脉COX-2及COX-2mRNA平均吸光度值明显高于A组（P〈0．01）且与mPAP呈负相关（P〈0．01）。结论：环氧酶-2基因表达变化可能在慢性低氧高二氧化碳肺动脉高压形成中起调控作用。     

低氧时一氧化碳对PASMC增殖的影响及机制探讨

目的和方法 :应用MTT比色、原位杂交、免疫细胞化学技术检测内源性或外源性CO对低氧状态下PASMC增殖的作用以及对PDGF B和原癌基因bcl 2、突变型p5 3表达的影响 ,探讨CO抑制低氧状态下PASMC增殖的机制。结果 :各组PASMC中PDGF BmRNA原位杂交和PDGF B蛋白的免疫细胞化学染色均为阴性 ,单纯低氧组较正常对照组Bcl 2和突变型P5 3蛋白表达增强 (P <0 .0 1) ,Hemin和CO干预组Bcl 2和突变型P5 3蛋白表达低于单纯低氧组 ,而Hb干预组则高于单纯低氧组 (P <0 .0 1)。结论 :低氧时CO可能通过抑制Bcl 2和突变型P5 3的表达而抑制PASMC的增殖     

豚鼠气道及肺组织原癌基因表达与哮喘的相关研究

目的：为研究原癌基因在哮喘发病中的作用。方法：以卵白蛋白致敏豚鼠建立哮喘模型,用Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈ－ｅｒｎ－ｂｌｏｔ分子杂交及免疫组化技术,分别观察正常及哮喘发作后豚鼠气道上皮及肺组织中原癌基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｍｙｃ的表达水平。结果：正常豚鼠气道及肺组织中ｃ－ｆｏｓ及ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ无或很少表达,哮喘发作后豚鼠气道上皮及肺组织中ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达明显增强,３０ｍｉｎ达高峰,发作后４ｈ降至正常水平。地塞米松对ｃ－ｆｏｓ及ｃ－ｍｙｃｍＲ－ＮＡ有部分抑制作用。结论：原癌基因ｃ－ｆｏｓ及ｃ－ｍｙｃ在哮喘发病过程中可能起一定作用。     

低氧对培养的肺血管周细胞凋亡的影响

为了研究低氧是否影响肺血管周细胞凋亡并参与腺泡内无肌肺动脉的构型重建, 用ＴＵＮＥＬ法和免疫组化方法, 观察低氧（Ｈ） 组和低氧肺动脉内皮细胞条件培养液（ＨＥＣＣＭ） 组对肺血管周细胞凋亡发生率及抑凋亡基因ｂｃｌ２ 蛋白表达的影响。结果表明：Ｈ组和ＨＥＣＣＭ 组的凋亡指数明显较对照组减小。Ｈ 组和ＨＥＣＣＭ 组ｂｃｌ２ 蛋白的表达量分别是ＮＥＣＣＭ 组的１１７ 倍、１１３ 倍, 是Ｎ组的１３３ 倍、１２７ 倍。提示低氧诱导的抑凋亡基因ｂｃｌ２ 的过度表达, 对周细胞凋亡发生的抑制作用和低氧促进的周细胞增生过程可能都参与无肌肺动脉的构型重建, 与肺动脉高压的形成有关。     

SENP1在大鼠低氧性肺动脉高压形成中肺血管壁中表达及可能作用

目的:探讨大鼠低氧性肺动脉高压(HPH)形成过程中SENP1在肺小动脉的动态表达变化及作用。方法:40只成年雄性Wistar大鼠随机分为5组(n=8):对照组和缺氧3 d、7 d、14 d2、1 d组,常压间断低氧复制HPH大鼠模型。测各组大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥大指数(RVHI)、血管形态学指标;原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺内SUMO特异性蛋白酶-1(SUMO-specific proteases-1,SENP1)mRNA表达,免疫组化、Westernblot检测其蛋白质水平。结果:①缺氧7 d后,肺小动脉出现血管重塑,且mPAP明显上升;低氧14 d后,肺小动脉重塑更明显,mPAP达高峰。RVHI在低氧14 d后明显增加。②原位杂交显示,SENP1 mRNA在对照组肺小动脉壁呈阳性表达,低氧后其相对量无明显变化。RT-PCR显示肺组织SENP1 mRNA表达与原位杂交所观察到的肺小动脉壁SENP1 mRNA变化趋势一致;SENP1蛋白在对照组呈阳性表达,低氧7 d后其表达量开始呈进行性下降。Western blot显示肺组织内SENP1蛋白表达与免疫组化观察到的肺小动脉壁SENP1蛋白变化趋势一致。③SENP1蛋白与mPAP、重塑指数、RVHI均呈负相关。结论:慢性低氧诱导肺小动脉壁SENP1蛋白降解,进而可能在HPH发病过程中发挥一定的作用。     

慢性低氧所致肺动脉高压对大鼠肺血管平滑肌细胞及成纤维细胞中蛋白激酶CβI的膜转位和蛋白表达量的影响

目的通过观察慢性低氧所致肺动脉高压对大鼠肺血管平滑肌细胞及成纤维细胞中蛋白激酶CBI（PKCβI）的膜转位和蛋白表达量的影响,初步探讨PKCpI在慢性低氧诱导大鼠肺动脉高压的发生、发展过程中所起的作用。方法建立慢性常压低氧肺动脉高压大鼠模型,将雄性SD大鼠随机分为正常对照组、低氧1d、3d、7d、14d和21d组,应用蛋白免疫印迹和免疫组化技术检测肺动脉高压形成过程中大鼠肺血管平滑肌细胞及成纤维细胞中PKCβI的膜转位和蛋白表达水平。结果（1）RVSP和RV／（LV＋S）比值较正常对照组明显增加（P〈0．05）,低氧后3d、7d、14d和21d后大鼠肺血管明显增厚;（2）大鼠肺血管平滑肌细胞和成纤维细胞均有PKCβI的表达,且低氧14d后PKCβI的蛋白表达量较正常对照组相比降低（P〈0．05）。结论PKCβI蛋白表达量的下调可能参与了慢性低氧诱导的大鼠肺动脉高压肺血管重塑的发生、发展过程。     

慢性缺氧对大鼠肺内皮素表达的影响

本文以ＡＢＣ法和原位杂交技术,观察了慢性缺氧时大鼠肺组织内内皮素－１（ＥＴ－１）的表达情况,结果发现：①正常肺血管内皮细胞有少许ＥＴ－１样阳性染色物质呈现。②缺氧ＩＷ后,肺内ＥＴ－１含量增加,主要位于肺血管内皮细胞和支气管粘膜上皮细胞。③缺氧２Ｗ和３Ｗ后,ＥＴ１阳性免疫物质进一步增加,于肺泡细胞内也见到阳性染色。④缺氧１Ｗ后肺内ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达增加,缺氧２Ｗ和３Ｗ后,ＥＴ－１ｍＲＮＡ的表达进一步加强。提示缺氧可刺激肺内ＥＴ－１ｍＲＮＡ的表达,慢性缺氧时肺内ＥＴ－１持续分泌增加,这可能是缺氧性肺动脉高压发生的重要因素之一。