烟草精细胞两个群体的分离

高等植物的倾向受精是一个非常吸引人的研究课题,目前对其机理还不清楚.要想探索高等植物倾向受精现象,前提之一是要分离出一定数量的两个精细胞群体作为分子生物学研究方法的材料.以前的研究表明,烟草(Nicotiana tabacum L.)花粉管中的两个精细胞体积差异明显.这种异型性的精细胞可能与倾向受精有关.烟草是二胞型花粉,生殖细胞只在体内生长的花粉管中才分裂形成两个精细胞.用体内/体外技术培养出花粉管后,爆破花粉管即可释放出花粉管内含物,其中包括两个精细胞.用微量酶液可使两个精细胞分开.然后用显微操作器可挑选出两个大小不同、数量上千的精细胞群体.这种单一纯化的精细胞群体为用分子生物学方法区分两个精细胞的DNA和蛋白质差异打下基础.本研究是高等植物的第二例、二胞花粉植物中的第一例分离两个特定精细胞群体的尝试,为构建烟草两个精细胞的cDNA文库创造了条件.     

蓝猪耳精细胞的分离及两个精细胞群体的收集

蓝猪耳是二细胞型花粉,生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精细胞。用体内-体外技术培养出花粉管后,将其置于爆破液中即可释放出花粉管内含物,其中包括两个精细胞和营养细胞。在显微镜下两个精细胞具二型性：体积较大的精细胞与花粉管的营养核相连,体积较小的精细胞只与大精细胞连接。两个精细胞之间的连接比较结实,需用微量酶液将两个精细胞分开。用显微操作仪就可分别挑选出两个精细胞群体,分别有上百个细胞。蓝猪耳精细胞的成功分离为利用蓝猪耳开展离体受精研究打下了良好的基础。这种单一纯化的精细胞群体的获得为用分子生物学方法区分两个精细胞的特异基因和蛋白质创造了条件。     

烟草雌、雄配子DNA含量变化

采用显微分光光度法测定了烟草（Nieotiana tabacum）精细胞和卵细胞的DNA含量。烟草是二胞花粉,花粉萌发后生殖细胞在花粉管中分裂形成精细胞。授粉后45h花粉管到达子房,在花粉管内的精细胞DNA含量为1C。当花粉管在退化助细胞中破裂,释放出的两个精细胞开始合成DNA。在与卵细胞融合前,两个精细胞DNA含量接近2C。随着精细胞的到达及合成DNA,卵细胞也开始合成DNA,融合前的卵细胞DNA含量也接近2C。精、卵细胞融合后,合子DNA含量为4C。烟草雌、雄配子是在细胞周期的G2期发生融合,属于G2型。     

烟草雌、雄配子DNA 含量变化

采用显微分光光度法测定了烟草( Nicotiana tabacum) 精细胞和卵细胞的DNA 含量。烟草是二胞花粉, 花粉萌发后生殖细胞在花粉管中分裂形成精细胞。授粉后45 h 花粉管到达子房, 在花粉管内的精细胞DNA 含量为1C。当花粉管在退化助细胞中破裂, 释放出的两个精细胞开始合成DNA。在与卵细胞融合前,两个精细胞DNA 含量接近2C。随着精细胞的到达及合成DNA, 卵细胞也开始合成DNA, 融合前的卵细胞DNA 含量也接近2C。精、卵细胞融合后, 合子DNA 含量为4C。烟草雌、雄配子是在细胞周期的G2 期发生融合, 属于G2 型。     

杜鹃精细胞的分离

杜鹃成熟花粉为二胞型,含一个营养细胞和一个生殖细胞,其精细胞在花粉管中形成。应用半离体技术培养杜鹃已授粉花柱,使花粉管从花柱中长出,再用渗透压冲击法促使花粉管破裂,释放出一对与营养核相连的精细胞。分离的精细胞经FDA方法检测,证明具活性。用显微操作仪可收集数量较多的分离精细胞。     

朱顶红精细胞超微结构观察

精细胞是双受精作用的直接参与者,是生殖生物学中的重点研究对象之一。以往的研究表明,应用连续超薄切片和计算机辅助三维重组技术,结合免疫荧光定位,发现两个精细胞在体积和细胞器含量上存着差异,即精子的二型性,而且与营养细胞核三者构成紧密功能单位却雄性生殖单位（MGU）。微管对精细胞的性状的确定、运动和维持MGU的动态结构稳定具有重要的作用。本文应用透射电镜。详细观察了朱顶红花粉管中细胞的超微结构,并着重微管结构及其分布的观察。朱顶红成熟花粉为两细胞型。成熟花粉于26℃、黑暗条件下,在液体培养基（含10％蔗糖和100ppm硼酸）中培养13－18小时,然后收集花粉管,固定,供电观察并照相。朱顶红成熟花粉培养13小时后,生殖细胞在花粉管中完成核分裂和胞质分裂等两个过程。形成两个精细胞。形成的两个精细胞前后排列,营养核前导并靠近花粉管顶端。领头的精细胞的细胞质以很大的表面与营养核相互融合（图版1－1,2）,有时营养核与两个精细胞彼此穿插、缠绕（图版1－3）。两精细胞之间的壁上具有多胞质通道和含均质电子密度中等的基质（图版II－4）。精细胞质在核与共同壁之间的区域染色较深,经高倍放大,观察到此处含丰富的微管, 自由分布,但以纵向或斜向为主（图版II－5,6）。所有的微管构成松散的桶状网络存在于两精核之间,除此之外,其他区域无微管分布（图版II－7）。培养18小时之后,两精细胞的共同呈网状（图版II－8）,此时微管均成纵向排列,平行于细胞长轴,构成筐状结构包围状精核,但不构成紧密的束状,证明了前人的免疫荧光观察结果。从以上观察结果我们可以得出如下的结论,朱顶红花粉为两细胞型,因此在花粉管中形成的两个精细胞一般前后排列,跟在营养细胞后面,这种线状排列方式在其他植物中也观察到,可能有利于三者作为一个结构功能单位在花粉管中移动和对花粉管狭窄空间的进化适应。MGU形成得较晚,在生殖细胞和营养核进入花粉管后才形成,并一直维持到精核形成,与其他报道不同。精细胞发育过程中,微管的分布方式变化显著。精细胞中微管的分布仅限于共同的细胞壁和靠近茎核之间的区域,总体构成一个松散的桶状结构。精细胞发育后期,微管均成纵向排列,包围着精核,极似生殖细胞筐状的微管结构形式。     

枸杞雌、雄配子DNA含量与细胞周期变化的初步研究

枸杞是二胞花粉植物。花粉在柱头上萌发后生殖细胞在花粉管中分裂形成精细胞。在花粉管中,精细胞开始合成DNA,随着花粉管生长,精细胞DNA含量持续增加。当花粉管在退化助细胞中破裂,释放出的2个精细胞DNA含量达到1．92倍（1．92C）。在开花当天,卵细胞已合成了约1／3DNA,并持续增加。开花后30h,卵细胞中的DNA含量达到1．63C。在受精前,卵细胞中的DNA含量达到1．83C。精、卵细胞融合后,合子DNA含量为3．53C。去雄排除花粉管影响后,己合成1／5DNA的过熟卵细胞停止合成,表明卵细胞持续合成DNA需要花粉管的刺激。枸杞雌、雄配子在融合前合成DNA,在细胞周期的G,期发生融合,属于G2类型。     

被子植物受精机制的研究进展

被子植物的受精是一个复杂而精巧的过程。花粉管到达子房,通过退化助细胞进入胚囊,释放出两个精细胞。原来在花粉管中相互联结的两个精细胞在退化助细胞中分开,一个与卵细胞融合,另一个与中央细胞融合,完成双受精。目前对双受精过程中有关雌、雄配子识别的机制还知之甚少。本文介绍了目前被子植物精、卵细胞融合前后的细胞周期变化、退化助细胞的功能、精细胞在退化助细胞中迁移的研究动态、精细胞的倾向受精和卵细胞的激活等被子植物受精生物学领域中的一些新的研究成果和发展趋势。     

五唇兰精细胞的分离

五唇兰(Doritis pulcherrima)具二胞花粉,授粉后1 d即有花粉开始萌发,授粉后5 d开始有生殖细胞完成有丝分裂形成一对精细胞。通过人工授粉使花粉管在子房内发育,再利用花粉管直接爆破,成功分离出五唇兰的精细胞。成对的2个精细胞在直径大小、荧光强弱上均显示出较大差异,预示2个精细胞具有不同的前途。     

韭菜精细胞的分离(简报)

分离精细胞是在高等植物中开展离体受精研究的前提之一,也是开展精细胞分子生物学研究的前提 [1,2].对具三胞花粉的植物,精细胞的分离比较容易,将花粉粒直接撒到含一定渗透压的培养基中,花粉粒爆破释放出精细胞.     

Isolation of two populations of sperm cells from the pollen tube of Torenia fournieri

The two sperm cells of Torenia fournieri are dimorphic. The dimorphic character suggests that they might be preferentially involved in fertilization during in vivo fusion with the egg cell and central cell. To probe the mechanism of preferential fertilization, it is necessary to use the most current molecular techniques. For this purpose, populations of >1000 individuals of the two dimorphic sperm cells, Sua (unassociated with the vegetative nucleus) and Svn (associated with the vegetative nucleus) were isolated from pollen tubes that had grown out of the cut ends of the styles. The two sperm cells released from pollen tubes remained attached to one another. When the two attached sperm cells were transferred into a solution containing 0.01% cellulose, 0.01% pectinase, and 5% mannitol, the connection between the two cells disappeared, and they were easily separated using a micromanipulator. The collection of these two individual populations containing over a thousand cells will permit research on gametic recognition at the molecular level.     

从水稻花粉管分离精细胞(简报)

精细胞的分离是植物生殖工程的一个重要组成部分,是目前被子植物有性生殖研究的一个活跃领域[1,2]。随着精细胞分离技术的完善和分离出精细胞的植物类型的增加,目前对精细胞的分子生物学研究已有一些进展,主要是精细胞特异蛋白的分离[3,4]和cDNA文库的构建以及一些精细胞特异基因的分离[5,6]。     

Isolation of two populations of sperm cells and microelectrophoresis of pairs of sperm cells from pollen tubes of tobacco (Nicotiana tabacum)

Prior research has indicated that the two sperm cells of Nicotiana tabacum are dimorphic, suggesting that they may participate in preferential fertilization during in vivo fusion with the egg and central cells. To probe the mechanism of potential preferential fertilization in this plant, it will be necessary to use modern sensitive molecular techniques. For this purpose, two individual populations of two sperm cells, constituting the Svn (associated with the vegetative nucleus) and Sua (unassociated with the vegetative nucleus), were isolated in the thousands from tobacco pollen tubes with a micromanipulator as a preliminary step toward research on gametic recognition using molecular techniques. Microelectrophoresis of paired sperm cells from a single pollen tube was conducted at different developmental stages. Sperm cells isolated from 1-, 2-, 3- and 4-cm stylar lengths migrated to the negative pole, with the Sua displaying significantly greater electrophoretic mobility than the Svn, reflecting a more positively charged cell surface on the Sua. The sperm cells isolated from 1-cm style are very sensitive to electron potential in an electrophoretic field, presumably reflecting that they are still in a young state. Differences in cell surface charge between the Sua and Svn may be related with cell fate during fertilization. Supported by National Natural Science Foundation of CHINA (30170060)     

川百合精细胞的超微结构(英文)

川百合与朱顶红花粉管中的生殖细胞分裂行为非常不同。诸如：染色体行为、微管的组织形式和分布、包括着丝点、微管形成的时间,纺锤体的形状及间期周质微管网络在生殖细胞分裂过程中消失与否等。但这两种细胞具有某些共性,包括在有丝分裂前期缺乏早前期带微管（ＰＰＢ）,末期形成细胞板等。这两种植物精细胞的结构应有较大差异。我们曾报道了朱顶红精细胞的超微结构,本文详细从超微结构方面描述了川百合精细胞的特征。川百合花粉管的萌发采用半离体活体培养方式。１１～１８小时后,ＤＮＡ荧光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８和醋酸地衣红染色检查花粉管中生殖细胞和精细胞发育时期。切取含有分裂的生殖细胞和精细胞的花柱部分,按曾报道的方法固定、包埋、切片、染色及观察。在所有检查的花粉管中,两精子均前后排列（Ｆｉｇ．１～３）,营养核前导并靠近花粉管顶端（Ｆｉｇ．２,３）。Ｈ３３２５８染色可见两精核间以ＤＮＡ联系（Ｆｉｇ．３）。两个新形成的精核彼此分离（Ｆｉｇ．１）,后来又相互靠近,并维持一定距离（Ｆｉｇ．３）。偶尔一对精子与营养核靠近（Ｆｉｇ．２）。两精细胞被一共同的细胞壁连接,他们不仅被自己的质膜也被营养细胞的质膜包围构成周质。周质平坦光滑。共同壁横向     

Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis

In animal fertilization, multiple sperms typically arrive at an egg cell to "win the race" for fertilization. However, in flowering plants, only one of many pollen tubes, conveying plant sperm cells, usually arrives at each ovule that harbors an egg cell. Plant fertilization has thus been thought to depend on the fertility of a single pollen tube. Here we report a fertilization recovery phenomenon in flowering plants that actively rescues the failure of fertilization of the first mutant pollen tube by attracting a second, functional pollen tube. Wild-type (WT) ovules of Arabidopsis thaliana frequently (～80%) accepted two pollen tubes when entered by mutant pollen defective in gamete fertility. In typical flowering plants, two synergid cells on the side of the egg cell attract pollen tubes, one of which degenerates upon pollen tube discharge. By semi-in vitro live-cell imaging we observed that fertilization was rescued when the second synergid cell accepted a WT pollen tube. Our results suggest that flowering plants precisely control the number of pollen tubes that arrive at each ovule and employ a fertilization recovery mechanism to maximize the likelihood of successful seed set.