vWF-△Pro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FⅧ基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除.前肽缺失突变体vWF(vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白.为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合SspDnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性.结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21ng/mL,活性为1.78±0.18IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12ng/mL和1.05±0.13IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19ng/mL和1.95±0.22IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性.为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据.     

前肽缺失体vWF改善FⅧ基因断裂转移细胞的重链和活性分泌

通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-△Pro)基因,探讨了vWF-△Pro对双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因的影响.将vWF-△Pro基因和B-区缺失型FⅧ( BDD-FⅧ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29) ng/ml,明显高于未转vWF-△Pro基因细胞(87±15) ng/ml;未转vWF-△Pro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-△Pro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-△Pro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-△Pro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-△Pro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml).另外,转vWF-△Pro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FⅧ凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-△Pro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体.表明转vWF-△Pro基因可促进双链转FⅧ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础.     

前肽缺失vWF促进细胞分泌蛋白质剪接的L303E／F309S突变体凝血第八因子

该文旨在探索前肽缺失von Willebrand子（vWF-△Pro）对蛋白质剪接的L303E／F309S突变体凝血第八因子（FVIII）分泌的影响。将vWF-△Pro基因与蛋白内含子融合的F聊重链和轻链基因共转HEK293胞。结果显示,转vWF－△Pro细胞的剪接蛋白FVIll分泌量和活性分别为（196±27）ng／mL和（1．39±0-31）IU／mL,明显高于对照细胞的（116±24）ng／mL和（0．91±0．18）IU／mL。表明vWF－△Pro可提高剪接的L303E／F309S突变体FVⅢ蛋白分泌量和活性。     

A1区替换提高人BDD-FⅧ重链的分泌并缓解其与轻链共转基因细胞链分泌的不均衡性

双载体转凝血Ⅷ因子基因(FⅧ)可有效克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但FⅧ重链分泌的低效性导致重、轻链分泌的不均衡。重链分泌的低效性源自其A1区存在与内质网蛋白质分子伴侣结合的位点。本文在我们最近运用蛋白质剪接的双载体共转B区缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因研究的基础上,将重链的A1区替换为猪FⅧ的A1区,用融合蛋白内含子的重链和轻链转基因实验,定量分析了重链的分泌及其对共转重链和轻链基因细胞分泌剪接BDD-FⅧ蛋白和活性的影响。结果显示,变构体重链单独转基因时其分泌得到明显改善,达到89±12 ng/ml,明显高于人BDD-FⅧ重链的分泌(25±9 ng/ml);该变构体重链与轻链共转基因细胞分泌的剪接变构体BDD-FⅧ和活性分别为219±51 ng/ml和1.47±0.22 U/ml,明显高于剪接的人BDD-FⅧ的分泌量和活性(1 16±32 ng/ml和0.8±0.11 U/ml)。单独变构体重链和轻链转基因细胞合并培养后,其培养上清中检测到剪接的变构体BDD-FⅧ和活性,分别为38±7 ng/ml和0.22±0.05 U/ml,提示为不依赖细胞机制的蛋白质剪接所产生。结果表明,A1区替换后重链分泌的增强,可促进基于蛋白质剪接技术的双载体共转重链和轻链基因细胞分泌的剪接BDD-FⅧ水平和活性,并可缓解链分泌的不均衡性,为动物体内应用双AAV载体共转BDD-FⅧ重链和轻链基因研究奠定了实验基础。     

BiP表达下调改善双载体转断裂FVIII基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效. 为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响. 结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长; ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL). 结果表明, BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.     

酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达

最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ (BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生．为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro¹⁶⁴⁰～Ser¹⁶⁹⁰的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响．用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接．结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26) μg/L和(1.31±0.15) U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12) μg/L和(0.79±0.09) U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用．而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7) μg/L和(0.28±0.08) U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接．另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接．为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据．     

内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成

vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,因此VWD特别适合于基因治疗,但vWF基因过大(8.4 kb),难以为多数病毒载体特别是优点较多的腺相关病毒(AAV)载体承载.运用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能,研究了三重载体真核细胞共转断裂3段的vWF基因,以期通过转基因翻译后的蛋白质剪接作用形成完整的功能性vWF蛋白.将vWF的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段,分别与2种不同的内含肽即Ssp DnaE内含肽和Ssp DnaB内含肽编码序列融合,构建到真核表达载体pcDNA3.1(+),得到3个分别融合内含肽的vWF片段基因真核表达载体,共转染培养的293细胞,通过瞬时表达,电泳观察培养上清中的vWF多聚体形态,分析vWF蛋白量和凝血Ⅷ因子(FⅧ)结合力;通过共转FⅧ基因,分析了培养上清中的FⅧ蛋白量及生物活性.结果显示,通过内含肽的蛋白质反式剪接作用,共转内含肽融合的三片段vWF基因细胞上清,表现与正常人血浆和转vWF基因阳性对照细胞相似的vWF多聚体模式和FⅧ结合力,而且可明显提高转FⅧ基因后表达的FⅧ蛋白的分泌量和活性,提示剪接vWF蛋白的FⅧ载体功能的恢复.结果表明,内含肽可作为一种有效的技术手段进行三重载体共转断裂的vWF基因,为进一步基于内含肽的三重AAV转断裂vWF基因应用于VWD基因治疗研究、克服AAV的容量限制提供了依据.     

基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ因子基因转移

以intein的蛋白反式剪接为工具,研究了运用双载体的真核细胞凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因转移,通过翻译后剪接得到完整的功能性FⅧ蛋白.将B结构域大部分缺失（Δ761~1639）的人功能性FⅧ（BDD-FⅧ）cDNA于剪接所需保守残基Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与106和48个氨基酸的mini Ssp DnaB intein的N端（IntN）和C端（IntC）编码序列融合,构建一对在质粒pcDNA3.1的强启动子CMV驱动下的真核表达载体.用脂质体共转染至293细胞和COS-7细胞,培养48h后,收集细胞上清,用ELISA检测培养上清中剪接形成的BDD-FⅧ蛋白水平,用Coatest法检测上清的功能性FⅧ生物活性,并用Western blot观察细胞内的BDD-FⅧ蛋白质剪接.结果显示,两种细胞培养上清中有较高水平的剪接BDD-FⅧ蛋白形成,分别达到（137±23）和（109±22）ng/mL,由细胞内和细胞外（培养上清）的剪接共同组成 并检测到培养上清中较高水平的FⅧ生物活性,分别为（1.05±0.16）和（0.79±0.23）IU/mL,包括细胞内、外剪接产物BDD-FⅧ共同形成 细胞总蛋白的Western blot进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-FⅧ蛋白.表明intein可用于双载体系统真核细胞FⅧ基因转移,并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高FⅧ生物活性的BDD-FⅧ蛋白,为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体（AAV）转运FⅧ基因,克服AAV载体的容量限制提供了依据.     

亮氨酸拉链提高小鼠血浆中剪接的凝血因子Ⅷ凝血活性

培养细胞实验表明,亮氨酸拉链通过改善内含肽(intein)的蛋白质剪接效率,提高双载体转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)基因细胞剪接FⅧ蛋白的分泌量和活性.本文从C57BL/6小鼠门静脉注射含亮氨酸拉链和Ssp DnaB内含肽融合的BDD-FⅧ的重链和轻链基因双表达载体,48 h后,检测到血浆的重链分泌量和FⅧ活性分别为(298±67)μg/L和(1.15±0.29)U/mL,明显高于不含亮氨酸拉链的双载体转BDD-FⅧ基因对照小鼠((179±59)μg/L和(0.58±0.19)U/mL).结果表明,亮氨酸拉链通过改善蛋白质反式剪接,提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因小鼠血浆的凝血活性,为进一步双腺相关病毒(AAV)载体转BDD-FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了依据.     

Met662和Asp1828的Cys突变增强蛋白内含子对共表达的BDD-FVIII因子重链和轻链的剪接

本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成,改善蛋白质反式剪接效率,提高双载体转BDD FVⅢ基因功效. 将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys,用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞,Western印迹检测到细胞内BDD-FVⅢ剪接量的提高以及重、轻链间二硫键的形成,用ELISA和Coatest测得细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FVⅢ的量(119±14 ng/mL)和活性(1.06±0.08 IU/mL),明显高于野生型BDD FVⅢ重链和轻链基因共转染细胞的量(81±12 ng/mL)和活性(0.70±0.15 IU/mL);混合培养的转突变重链和轻链基因细胞培养基中剪接BDD FVⅢ的量(17±5 ng/mL)和活性(0.15±0.03 IU/mL),与混合培养的转野生型重链和轻链基因细胞 (分别为21±9 ng/mL和0.18±0.05 IU/mL)相近,反映不依赖细胞机制的蛋白质反式剪接. 结果表明,重、轻链间二硫键形成通过增强蛋白质反式剪接提高双载体转BDD FVⅢ基因的功效. 为进一步运用双AAV载体动物体内转BDD-FVⅢ基因提供了实验依据.     

BiP表达下调改善双载体转断裂FⅧ基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效.为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响.结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长;ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL).结果表明,BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.     

猪VⅢ因子A1和A3结构域对翻译后剪接的人/猪杂合VⅢ因子的促分泌作用

凝血VⅢ因子(fVⅢ)蛋白的低效分泌以及基因过大是基于转fVⅢ基因的甲型血友病基因治疗的不利因素。本室前期用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接实验证明,运用双载体共转fVⅢ基因,通过翻译后蛋白质剪接,轻链可顺式促进fVⅢ蛋白的分泌。本文用猪fVⅢ蛋白的A1和A3结构域替换人fVⅢ蛋白相应的结构,构建人/猪杂合fVⅢ(human/porcinehy-bridfVⅢ,HP-fVⅢ),研究基于内含肽的双载体转HP-fVⅢ基因后剪接HP-fVⅢ的分泌和活性。构建一对分别融合SspDnaB内含肽的HP-fVⅢ重链和轻链基因表达质粒,瞬时共转染COS-7细胞,用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中HP-fVⅢ的剪接和生物活性,用Western blotting检测了细胞内HP-fVⅢ的剪接。结果显示,双载体转HP-fVⅢ基因细胞上清的剪接HP-fVⅢ蛋白量为(184±34)ng/mL,活性为(1.18±0.22)IU/mL,明显高于双载体转人fVⅢ基因[蛋白量为(48±12)ng/mL,活性为(0.31±0.10)IU/mL],提示猪fVⅢ的A1和A3结构域能显著促进内含肽剪接的HP-fVⅢ的分泌和活性;另外,还在混合培养的分别转内含肽融合HP-fVⅢ重链和轻链基因细胞上清中检测到剪接的HP-fVⅢ蛋白量为(27±5)ng/mL,活性为(0.19±0.07)IU/mL,提示内含肽对HP-fVⅢ的剪接可不依赖细胞机制,分泌出胞的前体蛋白仍可进行剪接反应;双载体转HP-fVⅢ基因细胞内检测到与转hfVⅢ基因阳性对照细胞内hfVⅢ条带大小接近的剪接HP-fVⅢ蛋白条带,进一步证实HP-fVⅢ的剪接。该结果为进一步在动物体内应用内含肽的双腺相关病毒载体转HP-fVⅢ基因奠定了实验基础。     

二硫键形成促进双载体转断裂B区缺失型凝血因子Ⅷ基因

双载体共转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因是克服腺相关病毒载体(AAV)容量限制的一种策略, 但重链分泌的低效性产生链不均衡性,影响转基因的功效．假设重、轻链链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,本文将BDD-FⅧ的重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys．双载体培养的COS-7细胞共转染突变重链和轻链基因,Western blot显示细胞内二硫键交联的重、轻链蛋白形成,ELISA和Coatest分析细胞培养上清的BDD-FⅧ重链分泌量和生物活性,分别为(109 ± 13) μg/L和(0.65 ± 0.12) U/ml,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞((71 ± 11) μg/L和(0.35 ± 0.05) U/ml)．结果表明,链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,为进一步动物体内运用双AAV载体转BDD-FⅧ基因提供了实验依据．     

前肽缺失体vWF改善FVIII基因断裂转移 细胞的重链和活性分泌

通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-ΔPro)基因,探讨了vWF-ΔPro对双载体转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因的影响。将vWF-ΔPro基因和B-区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29)ng/ml,明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(87±15)ng/ml;未转vWF-ΔPro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-ΔPro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-ΔPro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-ΔPro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml)。另外,转vWF-ΔPro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FVIII凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-ΔPro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体。表明转vWF-ΔPro基因可促进双链转FVⅢ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础。     

双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FⅧ基因

用双载体转运凝血Ⅷ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该文用双载体转B结构域大部缺失型FⅧ(BDD-FVⅢ)的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为(125±29)ng/mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的(75±23)ng/mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为(0.78±0.29)U/mL,也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞(0.34±0.12)U/mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FⅧ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。     

L303E/F309S突变促进细胞分泌内含肽连接的B区缺失型凝血VIII因子

凝血VⅢ因子(FVⅢ)尽管与凝血V因子具有相似的结构,但其分泌的低效性不仅限制了重组产品在甲型血友病患者中的广泛应用,也困扰基于转FVⅢ基因的基因治疗。为了提高FVⅢ的分泌效率,在我们以前用内含肽(intein)的蛋白质剪接功能介导的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因研究的基础上,探讨了重链L303E/F309S双突变对剪接BDD-FVⅢ蛋白分泌的影响。PCR突变法将L303E/F309S双突变引入我们以前构建的融合Ssp DnaB内含肽的野生型重链(HCIntN),得到融合内含肽的重链突变基因(DMHCIntN),与融合内含肽的轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA检测了培养上清中的重链多肽和剪接的BDD-FVⅢ蛋白浓度,用Coatest法分析了培养上清的凝血生物活性。结果显示,单独转DMHCIntN和DMHCIntN与IntCLC共转染细胞上清中的分泌的重链多肽浓度分别为(35±12)ng/ml和(178±19)ng/ml,高于单独转HCIntN细胞和HCIntN与IntCLC共转细胞[(14±6)ng/ml和(127±23)ng/ml];共转DMHCIntN和IntCLC细胞上清中剪接的BDD-FVⅢ蛋白浓度和活性分别为(128±24)ng/ml和(1.01±0.15)U/ml,明显高于共转HCIntN和IntCLC细胞[(90±12)ng/ml和(0.71±0.14)U/ml];另外,单独转DMHCIntN和IntCLC的细胞合并培养后的上清也检测到剪接的BDD-FVⅢ蛋白[(20±3)ng/ml]和活性[(0.17±0.07)U/ml]。结果表明,双突变可提高重链的分泌效率并明显被轻链顺式提高,伴之以剪接BDD-FVⅢ的分泌增加,表明内含肽对双载体转BDD-FVⅢ基因功效的改善并表现出不依赖细胞机制的BDD-FVⅢ剪接作用。为进一步动物体内实验运用内含肽的双AAV转重链双突变BDD-FVⅢ基因研究奠定了基础。     

双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FVⅢ基因

摘要用双载体转运凝血VⅢ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该丈用双载体转B结构域大部缺失型FVⅢ（BDD-FVⅢ）的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为（125＋29）ng／mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的（75＋23）ng／mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为（0．784±0．29）U／mL．也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞（0．34＋0．12）U／mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FVⅢ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。     

基于蛋白质剪接的BHK细胞Ser~(660)前断裂的CFTR基因转移

利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接技术,研究双载体真核细胞转囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因,通过翻译后连接成为完整的功能性CFTR蛋白.应用基因重组技术,将人CFTRcDNA于剪接反应所需保守残基Ser660前断裂为N端和C端两部分,分别与split Ssp DnaB intein编码序列融合,构建到真核表达载体pEGFP-N1和pEYFP-N1.用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),48h后Western印迹观察CFTR蛋白质的连接,并用全细胞和单通道膜片钳技术记录Cl-通道电流.基因共转染细胞可观察到明显的由蛋白质反式剪接形成的完整CFTR蛋白,膜片钳记录到较高的全细胞Cl-电流和与转野生型CFTR基因细胞相似的单Cl-通道开放活性,提示CFTR功能的恢复.内含肽可作为一种技术策略用于双载体转CFTR基因,为应用双腺相关病毒载体(AAV)转基因的囊性纤维化疾病(CF)基因治疗提供了依据.     

丙型肝炎病毒F蛋白缺失对病毒复制及感染性的影响

探索了F蛋白缺失及核心蛋白(Core)二级结构改变对丙型肝炎病毒(HCV)复制和感染性的影响．利用定点突变方法,将J6JFH1的核心基因引进5个终止密码子以中断F蛋白的表达,从而获得F蛋白缺失的病毒复制子J6JFH1/ΔF．体外制备RNA转录体,并电穿孔转染Huh7.5.1细胞,采用免疫荧光、实时荧光定量PCR方法以及病毒感染等方法,观察F蛋白缺失对病毒复制、蛋白质表达及转染细胞上清感染性病毒颗粒产生的影响．在此基础上,构建5个单一突变病毒体,对HCV核心蛋白进行二级结构分析,观察核心蛋白二级结构对HCV复制和翻译的影响．结果显示,转染48 h后,J6JFH1/ΔF与野生型J6JFH1相比,J6JFH1/ΔF转染阳性细胞数明显降低,细胞内HCV RNA 水平降低约95%,J6JFH1/ΔF转染后不同时间点细胞上清中HCV RNA拷贝数和病毒颗粒也明显降低．5个单一突变体不影响核心基因二级结构,病毒在细胞内复制和感染性与野生型水平一致．J6JFH1/ΔF所产生的改变可能是由于5处突变导致核心基因二级结构改变而造成的．结果说明,HCV F蛋白缺失不影响病毒的复制翻译及病毒颗粒的包装释放,核心蛋白二级结构的改变对病毒复制和翻译则产生较大影响．     

HA纳米载体介导转hGM-CSF基因的HepG2疫苗诱导的 抗瘤效应研究

目的:观察HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因的HepG2细胞疫苗体外抗肿瘤效应,为hGM-CSF基因修饰的HepG2细胞疫苗的临床应用提供依据。方法:HA纳米颗粒载体介导hGM-CSF基因转染HepG2细胞制备转GMCSF基因的HepG2细胞疫苗。密度梯度离心法分离人PBMC,体外诱导人PBMC。WST-1法测定PBMC的增殖活性及对HepG2细胞的杀伤效应,流式细胞术分析CD4+和CD8+的阳性表达率,ELISA法测定INF-γ的分泌。结果:WST-1结果显示,转基因HepG2组疫苗能诱导PBMC增殖,其增殖率优于野生型疫苗(p<0.05);其诱导的PBMC对HepG2的杀伤率高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。FCM结果显示,转基因HepG2疫苗组PBMC中CD4+和CD8+阳性表达率均高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。ELISA结果显示,转基因组PBMC培养上清中IFN-γ含量为1989.76±254.21pg/ml,高于各野生型疫苗组和各空白对照组(p<0.05)。结论:HA纳米颗粒载体介导转染hGM-CSF基因能增加HepG2细胞疫苗的免疫原性,转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗可有效诱导PBMC增殖、分化,增加INF-γ的分泌,提高其对HepG2细胞的杀伤作用。