短芽孢杆菌细胞壁蛋白基因多启动子和信号肽编码序列的分离

具有高蛋白分泌能力的短芽孢杆菌分泌到胞外的蛋白质主要是细胞壁蛋白,本通过PCR从5株筛得的具有高蛋白分泌能力且没有胞外蛋白酶活性的短芽孢杆菌中分离出细胞壁蛋白基因多启动子和信号肽编码序列,对其分析发现与具有高蛋白分泌能力的短芽孢杆菌47和HPD31的相应序列高度同源,该结果表明分泌蛋白能力强的短芽孢杆菌细胞壁蛋白的合在 可能受同样的机理调控。     

具有杀镰孢菌素合成功能基因菌株的筛选与鉴定

在NCBI数据库中搜索已知多黏类芽孢杆菌基因组中分别编码Fusaricidin合成酶3个NRPS功能区段的核苷酸保守序列,利用Primer5.0软件设计3对引物,对供试的95个细菌菌株进行PCR检测,筛选到1株阳性菌株T99,其3对引物扩增产物的测序结果表明,所得3个功能片段核苷酸序列与多黏类芽孢杆菌SC2和M1的Fusaricidin合成酶基因序列的一致性分别为99％、97％和99％,说明菌株T99基因组中具有Fusaricidin合成相关功能基因.结合形态特征及培养性状、生理生化特性和16SrDNA序列同源性分析的结果,将菌株T99鉴定为多黏类芽孢杆菌.     

稻瘟病菌含信号肽小蛋白的计算机分析

结合计算机技术和生物信息学的方法,采用组合的信号肽分析软件SignalPv3.0、TargetPv1.1、Big-PIpredictor、TMHMMv2.0和SecretomeP对已公布的1486个稻瘟菌(magnaporthegrisea)小蛋白基因的N-端氨基酸序列进行信号肽分析,同时系统分析了信号肽的类型及结构。分析结果表明,在1486个稻瘟病菌小蛋白中,119个具有N-端信号肽的典型分泌蛋白。其中116个具有分泌型信号肽,1个具RR-motif型信号肽,2个具信号肽酶II型信号肽。在稻瘟病菌基因组中,分泌型小蛋白的序列是高度趋异的,仅出现少数氨基酸组成完全一致的信号肽,为进一步确认具有相同信号肽的分泌蛋白是否具有同源性,分别用BLAST2SEQUENCES对具有相同信号肽的分泌蛋白进行了序列对比。结果表明,具有相同信号肽的分泌蛋白同源性非常高。同时还采用Sublocv1.0对1486个小蛋白的亚细胞位置进行了预测,结果显示小蛋白的可能功能场所包括细胞质、细胞外、线立体和细胞核,功能场所位于细胞核的小蛋白是最多的。     

利用基因组挖掘技术分析短短芽孢杆菌菌株GZDF3全基因组几丁质酶基因家族

本研究目的是利用全基因组挖掘技术分析短短芽胞杆菌GZDF3菌株中的几丁质酶基因家族。首先利用Bio Edit软件本地搜索短短芽孢杆菌GZDF3全基因组数据库中几丁质酶基因家族,然后采用在线分析及相应软件分析预测几丁质酶基因氨基酸组成、理化性质、信号肽、疏水性、二级结构等,并构建系统发育树。结果显示,短短芽孢杆菌GZDF3全基因组中预测共存在6个几丁质酶基因,编码6种不同结构类型的几丁质酶。6种几丁质酶均属于糖苷键水解酶第18家族。其中2种几丁质酶N端有信号肽序列和信号肽酶切位点;有2种几丁质酶为碱性蛋白,4种为酸性蛋白,6种均为亲水性蛋白。本研究揭示了短短芽孢杆菌菌株GZDF3基因组中有结构多样的几丁质酶,分析结果将为后续的基因克隆及功能研究提供参考。     

辣椒根腐病拮抗细菌的筛选及其生物学特性研究

以辣椒根腐病原菌(Fusarium solani)为指示菌,从贵州辣椒根际筛选到5株具有明显拮抗效果的细菌,编号分别为:SC2、SC2-4、SC2-4-1、SC2-4-2、SC2-4X.上述菌株抗菌谱较广,对黄瓜枯萎病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、黄瓜霜霉病原菌(Pseudoperonospora cubensis)、芹菜灰霉病原菌(Botrytis cinerea Pers)以及西红柿灰霉病原菌(Botrytis cinerea)也具有良好的拮抗性能.经形态学测定、生理生化分析和16S rDNA序列分析,将SC2、SC2-4-2、SC--4X鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),SC2-4、SC2-4-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).SC2菌株产生的抗菌物质可能为蛋白类或抗菌肽类物质.     

蜡状芽孢杆菌群中规律成簇间隔短回文重复序列的生物信息学分析

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是最近发现针对噬菌体等外源遗传物质的获得性和可遗传性的新型原核生物防御系统。通过BLAST、多序列比对、RNA二级结构预测等生物信息学方法对已经完成全基因组测序的蜡状芽孢杆菌群24个菌株进行CRISPR的系统分析,结果表明:42%的菌株含有该结构;8个CRISPR座位的正向重复序列可以形成RNA二级结构,提示正向重复序列可能介导外源DNA或RNA与CAS编码蛋白的相互作用;31%的间区序列与噬菌体、质粒、蜡状芽孢杆菌群基因组序列具有同源性,进一步验证间区序列很可能来源于外源可移动遗传因子。由于大部分蜡状芽孢杆菌群菌株含有多个前噬菌体和质粒,通过对蜡状芽孢杆菌群CRISPR的分析,为揭示其对宿主菌与噬菌体,以及宿主菌与质粒间的关系奠定基础。     

地衣芽孢杆菌DSM13分泌蛋白信号肽分析

地衣芽孢杆菌是重要的工业微生物,对于其分泌途径及信号肽进行预测和分析,有助于改善影响蛋白分泌的关键因素,高效生产异源蛋白。本研究首次在全基因范围内,利用SignalPv3.0等方法识别了地衣芽孢杆菌DSM13中各种分泌蛋白的信号肽。DSM13信号肽类型包括分泌型Sec信号肽、双精氨酸Tat信号肽、脂蛋白信号肽、IV型纤毛结构信号肽及生物信息素信号肽。同时分析了分泌途径组成,信号肽长度,氨基酸组成,各分泌信号肽特征,与枯草芽孢杆菌的异同以及重要工业酶制剂的分泌途径。该研究对使DSM13成为更有效分泌表达外源蛋白表达系统,具有重要的理论指导意义。     

秀丽小杆线虫分泌蛋白组的计算机分析

结合计算机技术和生物信息学的方法,采用组合的信号肽分析软件SignalP v3.0、TargetP v1.01、Big-PI Predictor和TMHMM v2.0,预测了秀丽小杆线虫（Caenorthaditis elegans ws123）的全基因组19855个ORF编码蛋白的信号肽,同时系统分析了信号肽的特征。结果表明,在19855个秀丽小杆线虫的蛋白中,有1990条为带有信号肽的分泌型蛋白,其中,1936条为典型的分泌型信号肽（即信号肽酶Ⅰ型信号肽）,53条为信号肽酶Ⅱ型信号肽,1条为信号肽酶Ⅳ型信号肽;在Ⅰ型信号肽中,有41条为RR-motif亚组型信号肽。在1990条信号肽中,有742条没有典型的N-区,其余1248条包含典型的3个区。比较了秀丽小杆线虫与原核生物分泌蛋白信号肽中20种氨基酸残基在信号肽酶切位点的使用情况,表明：在Ⅰ型信号肽酶切位点,其信号肽中使用的氨基酸总体趋势与原核生物基本相似,但秀丽小杆线虫选用的氨基酸种类更多,变化更大;在Ⅱ型信号肽酶切位点,秀丽小杆线虫脂蛋白信号肽中使用的氨基酸的种类与原核生物有很大的不同。通过与真核单细胞生物比较,作为真核多细胞生物的秀丽小杆线虫,其分泌蛋白信号肽所占比例更高、种类更多,可知线虫信号肽的组成具有很高的多态性,表明该物种的分泌蛋白具有多种功能。此外,分析结果显示,脂蛋白信号肽在结构上比分泌型信号肽更为保守。在秀丽小杆线虫分泌蛋白中出现了少数氨基酸组成完全一致的信号肽,采用BLAST 2 SEQUENECES对具有相同信号肽的分泌蛋白进行了序列比对,结果表明具有相同信号肽的分泌蛋白同源性非常高,它们的存在是生物进化过程中基因倍加（duplication）及环境选择的结果,信号肽特征的详细描述必将对这些蛋白功能的研究提供重要的帮助。      

双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定

利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终构建了双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体pSBPTQ。将VasostatinⅠ基因作为靶基因检测sacBp.s.、α-amyT和degQ在pSBPTQ进行外源基因表达时的功能,结果表明,在蔗糖诱导下,sacB启动子有效启动了Vasostatin I基因的表达和分泌,α-amy T提高了VasostatinⅠ基因的转录效率,而degQ明显增强了VasostatinⅠ基因的表达水平。VasostatinⅠ基因在蔗糖诱导下成功表达并分泌到枯草杆菌细胞外,蛋白质分泌效率达到90%左右。质粒稳定性试验结果表明,经过40个世代之后,质粒pSBPTQ在枯草杆菌DB1342中仍旧保持在83%以上。     

嗜碱芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶基因启动子的克隆及应用

摘要: 利用TAIL-PCR方法从嗜碱芽孢杆菌PB92基因组中扩增出碱性蛋白酶基因上游启动子活性片段, 测序分析后登录GenBank(EU130686)。此序列具有多个启动子特征区域, 且在－538~－370 bp和－275~－128 bp两个区域存在反向读码框。对启动子片段进行功能缺失的分析结果表明, TSS上游105 bp片段具有明显启动子活性, 但以长为414 bp~619 bp时活性更为显著。此外, 对PB92碱性蛋白酶的信号肽分析结果表明, 此信号肽具有典型分泌型(Sec-type)信号肽结构。将PB92碱性蛋白酶基因启动子和信号肽序列克隆入pBE2, 构建成表达载体pBEAC, 并以其为载体实现了植物甜蛋白monellin基因在枯草芽孢杆菌1A751中的高效表达。     

产高活性抗凝溶栓双活性蛋白的短小芽孢杆菌的筛选及鉴定

【目的】筛选可产生抗血栓活性物质的细菌。【方法】利用VY/4平板、酪蛋白平板从水样、土样、兔粪、羊粪、朽木等20多个样品中筛选目的菌株;利用纤维蛋白平板和纤维蛋白试管检测抗血栓活性;利用形态学特征、理化性质、16S rRNA序列同源性鉴定目的菌株。【结果】得到5株可产生抗血栓活性物质的细菌,重点研究了菌株LDS33,发现其分泌的胞外蛋白在纤维蛋白平板上和纤维蛋白试管中均显示出强烈的溶栓活性,通过试管法发现此蛋白质同时具有较强的抗凝活性。结合形态学、理化性质、16S rDNA序列及进化树分析,发现该菌株属于硬壁菌门芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌,将其命名为Bacillus pumilus LDS.33。【结论】短小芽孢杆菌LDS33可产生高活性的抗凝溶栓双活性蛋白。     

植物病原真菌广谱拮抗菌的筛选鉴定及发酵条件初步研究

通过对峙培养法筛选到对8种植物病原真菌具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株,通过测量10-30℃下的抑菌圈直径发现AFB037菌株在不同温度下抑菌效果最好。通过表型和16S rDNA序列分析将AFB037菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌。AFB037菌株抗菌成分的产生需要真菌菌体成分的诱导,提示其有效成分可能为细胞壁降解酶类。     

产高活性抗凝溶栓双活性蛋白的短小芽孢杆菌的筛选及鉴定

摘要:【目的】筛选可产生抗血栓活性物质的细菌。【方法】利用VY/4平板、酪蛋白平板从水样、土样、兔粪、羊粪、朽木等20多个样品中筛选目的菌株;利用纤维蛋白平板和纤维蛋白试管检测抗血栓活性;利用形态学特征、理化性质、16S rRNA序列同源性鉴定目的菌株。【结果】得到5株可产生抗血栓活性物质的细菌,重点研究了菌株LDS33,发现其分泌的胞外蛋白在纤维蛋白平板上和纤维蛋白试管中均显示出强烈的溶栓活性,通过试管法发现此蛋白质同时具有较强的抗凝活性。结合形态学、理化性质、16S rDNA序列及进化树分析,发现该菌株属于硬壁菌门芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌,将其命名为Bacillus pumilus LDS.33。【结论】短小芽孢杆菌LDS33可产生高活性的抗凝溶栓双活性蛋白。     

1株抗菌植物内生菌EJH-2菌株的分离和鉴定

目的从中药植物金银花的组织中分离到1株具有抗菌活性的植物内生菌EJH-2菌株,并对其进行了分子生物学鉴定。方法通过总DNA提取,PCR扩增,得到1300bp的16S rRNA序列。PCR产物序列通过BLAST软件在NCBI网站中进行同源性比较。通过Bioedit7．0和Treedrawing软件绘制系统发育树。结果EJH-2的16SrRNA序列和数据库中的类多粘芽胞杆菌KCTC 1663菌株的序列的同源性为99．76％。在系统发育树中,EJH-2菌株和多粘类芽胞杆菌在同一分支。结论EJH-2菌株应归属于多粘类芽胞杆菌（Paenibacillus polymyxa）。     

芽孢杆菌分泌型表达载体的构建

以地衣芽孢杆菌(B．Lichenformis)α－淀粉酶信号肽编码区为基础构建了具有Pst I、NheⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SalⅠ多酶切点的芽孢杆菌分泌型载体pAMY403,其分泌效率与质粒pAMY 413相同,而表达水平提高了50％,并能使外源β－内酰胺酶基因正常表达和分泌。粒pAMY403多酶切点可以满足外源基因插入产生非融合蛋白质,也可满足以三种不同读码框架插入外源基因产生融合蛋白质,因而能适应构建不同分泌型工程菌株的要求。     

利用短短小芽孢杆菌启动子和信号肽编码序列构建穿梭分泌表达载体

以短短小芽孢杆菌B15的总DNA为模板,利用PCR技术克隆到其细胞壁蛋白基因串联启动子和信号肽编码序列,测序分析后提交GenBank,登录号为AY956423。重新设计引物扩增该片段并在PCR产物两侧引入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点,将PCR产物双酶切后克隆至穿梭载体pP43NMK的相应位点构建分泌表达载体pP15MK,插入片段置于该载体中mpd基因的上游,并使信号肽编码序列与去除了自身信号肽编码序列的mpd基因阅读框恰好融合。将pP15MK导入枯草杆菌构建表达菌株1A751(pP15MK),在短短小芽孢杆菌启动子和信号肽元件的带动下,mpd基因能够在表达菌株的对数生长期和稳定期持续性高效分泌表达,表达产物结合在细胞膜上;发酵液在48h酶活达到最高值7.79U/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的8.1倍。     

信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用

信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用,分泌性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中。可以利用因特网在线工具和信号序列捕获系统来判定基因序列中是否含有信号肽序列。外源蛋白的表达形式多为细胞内不溶性表达(包涵体),少数为细胞外分泌表达。利用信号肽来引导外源蛋白分泌可避免因包涵体复性带来的困难。研究表明,多种外源基因连接上信号肽后在原核表达系统如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达;信号肽也广泛应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统,以提高蛋白的表达量。     

DrwH类信号肽序列对其抗氧化功能的影响

耐辐射异常球菌疏水性LEA5C家族蛋白DrwH参与细胞耐受氧化和盐胁迫过程。前期研究发现,DrwH蛋白N端存在19个氨基酸组成的类信号肽序列,为探索该序列对DrwH发挥抗氧化功能的影响,本研究通过对DrwH蛋白进行分段截短,构建含有不同区段的重组大肠杆菌菌株,比较分析重组菌株在正常培养和氧化胁迫下的生长能力。结果表明,含有类信号肽序列的融合蛋白过量表达不仅抑制了大肠杆菌的生长,而且使DrwH蛋白失去抗氧化能力。荧光定量PCR显示经IPTG诱导后,含类信号肽全长蛋白DrwH和结构域蛋白WHy在转录水平大量累积,蛋白在过量积累条件下发挥其生物学功能。由此表明,类信号肽对全长蛋白DrwH表达及其发挥抗氧化功能具有重要影响。     

曾候乙墓穴木椁微生物的分离与鉴定

从曾侯乙墓中椁室、东椁室、西椁室和北椁室分别取样,经平板划线培养,分离,纯化共获得典型的菌株16株。将16株分别涂片镜检,生理生化分析鉴定,结果证明芽孢杆菌属11株,其中苏云金变种1株,地衣芽孢杆菌1株,巨大芽孢杆菌1株,球形芽孢杆菌5株,蜡状芽孢杆菌2株,多粘芽孢杆菌1株。其余菌株微杆菌属4株,黄色杆菌属黄杆菌1株。     

枯草芽孢杆菌SC2-4-1葡聚糖酶基因gluB的克隆及序列分析

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,从辣椒根际筛选的拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC2-4-1能产生β-1,3-1,4-葡聚糖酶.以菌株SC2-4-1的基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了该菌的葡聚糖酶基因gluB,其开放阅读框为711bp,编码237个氨基酸.Blast分析,该序列与已报道的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ATCC 842的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB相似性为85%.所得基因序列的系统发育分析显示,该基因属于β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因.DNAMAN软件比对,所得葡聚糖酶氨基酸序列具有催化裂解β-1,3-和β-1,4-糖苷键的葡聚糖酶活性位点.