下调烟粉虱MED隐种BtabCSP6表达对番茄黄化曲叶病毒传播的影响

【目的】番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)是对农业生产造成威胁的主要病毒之一,自然条件下通过媒介昆虫烟粉虱Bemisia tabaci传播。已有研究表明烟粉虱雌成虫比雄成虫具有更强的获毒与传毒能力。本研究旨在探明烟粉虱化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)基因BtabCSP6表达对病毒传播的影响,为控制病毒发生寻找新途径。【方法】使用TYLCV侵染性克隆方法获得带毒番茄植株,微虫笼收集不带毒烟粉虱MED隐种成虫固定在感染TYLCV的番茄植株叶片获毒48 h;利用RT-qPCR技术测定分别取食感染和未感染TYLCV番茄植株的烟粉虱MED隐种雌雄成虫体内BtabCSP1-8基因表达量变化;通过饲喂法利用RNAi对烟粉虱MED隐种雌成虫BtabCSP6基因进行干扰48 h后饲喂TYLCV感染的番茄植株,测定烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和传毒率。【结果】RT-qPCR检测结果表明,与未侵染的烟粉虱MED隐种雌成虫相比,侵染TYLCV的雌成虫体内BtabCSP3和BtabCSP6基因的表达量变化最为显著。同样地,在侵染TYLCV的雄成虫体内,BtabCSP4和BtabCSP6表达量的变化最为明显。饲喂dsBtabCSP6 48 h后,烟粉虱MED隐种雌成虫体内BtabCSP6表达量降低;取食感染TYLCV番茄植株不同时间烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和不同数量雌成虫对未感染TYLCV的番茄植株的传毒率与对照相比均显著降低。【结论】下调烟粉虱MED隐种雌成虫体内BtabCSP6基因的表达,可显著降低烟粉虱MED隐种雌成虫的获毒率和传毒率,说明BtabCSP6可能影响TYLCV传播。     

烟粉虱MED隐种抑制蛋白基因Btarrestin的克隆及特性分析

【目的】明确烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种抑制蛋白基因Btarrestin是否参与吡虫啉耐药性。【方法】根据已有烟粉虱转录组数据,利用RT-PCR克隆Btarrestin的全长序列,进行生物信息学分析。通过qPCR分析Btarrestin在烟粉虱MED隐种各个龄期(卵,1-2龄、3龄、4龄若虫,雌、雄成虫)以及吡虫啉处理(100 mg/L)后成虫中的表达量变化,明确其时空表达模式。利用RNAi技术沉默Btarrestin,观察沉默前后Btarrestin表达量和烟粉虱MED隐种成虫死亡率变化。【结果】成功克隆烟粉虱MED隐种Btarrestin的cDNA序列(GenBank登录号: MK204377),编码区全长1 227 bp,编码409个氨基酸,预测所编码的蛋白分子量约为45.33 kD,理论等电点(pI)为8.38。保守结构域分析表明,Btarrestin具有Arrestin_N和Arrestin_C两个超家族保守结构域,符合抑制蛋白家族特征。分子系统树分析表明,Btarrestin与褐飞虱Nilaparvata lugens的Arrestin亲缘关系最近。Btarrestin的表达量随烟粉虱MED隐种的生长发育逐渐升高,成虫期表达量最高。100 mg/L吡虫啉处理成虫24 h后Btarrestin的表达量较对照增加了2.39倍。RNAi干扰Btarrestin后进行生物测定,烟粉虱MED隐种成虫的死亡率上升了31.27％。【结论】Btarrestin可能与烟粉虱MED隐种对吡虫啉的耐药性有关。     

两个入侵烟粉虱隐种MEAM1与MED对番茄黄曲叶病毒水平传播能力的比较

【目的】烟粉虱 Bemisia tabaci 是番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）在自然界的唯一传播媒介,除了可以直接取食获取TYLCV,烟粉虱还可以通过交配获取此植物病毒。虽然前人研究证明了烟粉虱Middle East-Asia Minor 1 （MEAM1）和Mediterranean （MED）隐种都可以通过交配在两性个体之间水平传播TYLCV,但有关MEAM1与MED隐种水平传播TYLCV的能力是否存在差异,不同研究的结果却并不一致。另外,目前尚无关于烟粉虱的水平传播行为是否有助于TYLCV在田间扩散的相关研究。【方法】从浙江、广东、云南和河南4个省份的田间采集MEAM1和MED隐种烟粉虱种群,在室内应用分子标记对各种群所属隐种鉴定后分别建立7个供试种群,然后观察每个种群内带毒成虫与不带毒成虫通过交配在不同性别个体之间水平传播TYLCV的能力,并选用采自广东的MEAM1隐种烟粉虱模拟群体交配实验探究通过交配获毒的烟粉虱个体是否具有传播TYLCV致健康番茄植株发病的能力。【结果】4个省内的MEAM1和MED隐种烟粉虱都可通过交配对TYLCV进行水平传播,但传播频率一般在10%以下。不同省份的MEAM1隐种种群之间在水平传播TYLCV的能力上无显著差异,不同省份的MED隐种种群之间也不存在显著差异。另外,同一省份的MEAM1隐种与MED隐种之间在水平传播TYLCV的能力上也不存在显著差异,而且在两个隐种中,带毒雄虫将病毒水平传播给不带毒雌虫与带毒雌虫将病毒水平传播给不带毒雄虫的频率没有显著差异。研究还表明,采自广东的MEAM1隐种烟粉虱个体通过交配水平获毒后不能致健康番茄植株发病。【结论】综合以上结果,我们推测TYLCV在中国境内两个入侵烟粉虱隐种MEAM1和MED各自种群内个体之间的水平传播概率较低,对该病毒在田间的扩散可能没有作用或作用不大。     

烟粉虱MED隐种钙离子结合蛋白基因的RNAi及其生物学效应

【目的】前期研究发现烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种2个钙离子结合蛋白(BtCaBP1和BtCaBP2)参与烟粉虱对溴氰虫酰胺的应激反应。本研究旨在通过RNAi干扰钙离子结合蛋白基因,系统揭示钙离子结合蛋白对烟粉虱的生物学影响。【方法】通过dsRNA饲喂法分别干扰烟粉虱MED隐种成虫钙离子结合蛋白基因BtCaBP 1和BtCaBP 2后,qPCR检测BtCaBP 1和BtCaBP 2的表达量;观测并比较了RNAi 3 d后处理组(分别饲喂ds BtCaBP 1和ds BtCaBP 2)和对照组(饲喂ds EGFP)间烟粉虱MED隐种亲代成虫(雌雄)寿命、单雌产卵量以及子一代的卵孵化率和成虫前期发育历期等生物学参数。【结果】分别饲喂ds BtCaBP 1和ds BtCaBP 23 d后,处理组烟粉虱MED隐种靶标基因BtCaBP 1和BtCaBP 2的表达量较对照组均显著降低。处理组中干扰BtCaBP 2后的亲代烟粉虱MED隐种成虫寿命(雌:15.46±1.24 d;雄:13.84±0.38 d)较对照组的(雌:13.25±0.58 d;雄:12.67±0.65 d)显著延长;处理组的单雌产卵量(39.53±3.04)比对照组的(76.06±4.76)显著降低;处理组子一代卵孵化率(81.58%±4.42%)比对照组的(87.22%±3.21%)显著降低;子一代成虫前期发育历期处理组(24.42±1.09 d)比对照组的(27.52±1.73 d)显著缩短。而干扰BtCaBP 1基因后,亲代及子一代上述生物学参数没有显著变化。【结论】干扰BtCaBP 1和BtCaBP 2对烟粉虱MED隐种具有不同的生物学效应,该结果为后续进一步研究钙离子结合蛋白的生物学功能提供了参考。     

利用TaqMan等位基因技术鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种

MEAM1和MED是烟粉虱Bemisia tabaci两种重要的外来入侵隐种, 在我国部分地区常混合发生, 对我国农业生产造成了不同程度的危害和损失。尤其是MED隐种危害寄主范围更广, 对多种杀虫剂具有较高抗性, 防治上更为困难。因此, 如何快速鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种, 对于烟粉虱防治策略的选择具有十分重要的意义。本研究选择线粒体细胞色素氧化酶I(mitochondrial cytochrome oxidase I, mtDNA COI)基因保守区域内的单核苷酸多态性（SNP）为靶标, 应用等位基因聚合酶链式反应技术, 借助TaqMan-MGB荧光染色标记探针, 建立了一种鉴定烟粉虱MEAM1和MED隐种的等位基因选择性PCR方法, 并对北京11个区县的14个烟粉虱种群进行了隐种鉴定。结果表明, 北京地区14个烟粉虱种群样本与已知烟粉虱MED隐种种群在荧光值分布上聚为一簇, 为MED隐种。该鉴定方法具备SNP基因分型的优点, 可快速、 可靠、 高通量地鉴定烟粉虱MEAM1和MED, 为烟粉虱隐种鉴定及遗传分化研究提供了新的可选途径。     

ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株上烟粉虱寄主适应性及寄主植物营养成分含量和防御反应变化

【目的】本研究以番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)为主体,旨在明确ToCV单独侵染及TYLCV&ToCV复合侵染对烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种寄主适应性的影响,并从寄主植物营养成分和防御角度解析不同番茄病毒侵染对烟粉虱MED隐种寄主适应性影响的生理机制。【方法】ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株后,统计分析番茄植株上烟粉虱MED隐种成虫存活率和产卵量以及番茄植株中氨基酸和总糖含量;通过RT-qPCR技术检测番茄植株茉莉酸(JA)信号通路关键基因(FAD7和PI II)以及水杨酸(SA)信号通路关键基因(NPR1和PR1)的表达模式。【结果】相对于取食健康番茄植株的烟粉虱成虫,取食番茄病毒侵染的番茄植株烟粉虱MED隐种成虫的存活率和产卵量均显著降低,其中以TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株为寄主时,烟粉虱MED隐种成虫的存活率和产卵量均达到最低水平。TYLCV&ToCV复合侵染后,番茄植株中总氨基酸含量、14种水解氨基酸含量以及总糖含量低于ToCV单独侵染番茄植株。ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株后,FAD7和PI II的表达量均显著降低,并且2个基因在TYLCV&ToCV复合侵染植株中的表达水平最低;然而,NPR1和PR1的表达水平在ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株中均有上升趋势,TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株中NPR1表达水平和ToCV单独侵染番茄植株中PR1表达水平均显著高于健康番茄植株中的。【结论】ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染均能够明显降低番茄植株上烟粉虱MED隐种的寄主适应性,且TYLCV&ToCV复合侵染更不利于烟粉虱MED隐种生存;相对于健康番茄植株,ToCV单独侵染和TYLCV&ToCV复合侵染番茄植株营养成分与防御系统发生了变化且存在差异。研究结果为揭示烟粉虱与植物病毒互作提供了参考。     

温室粉虱和烟粉虱3个隐种中热激蛋白基因hsp70和hsp90含量的比较分析

【目的】昆虫适应新环境的能力与其对温度的耐受能力密切相关。热激蛋白HSP70和HSP90具有提高生物体温度耐受性的功能。烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)不同隐种和不同种粉虱对温度的适应能力有差异,这与它们的热激蛋白基因拷贝数的差异可能相关。【方法】利用实时荧光定量PCR方法,检测入侵型烟粉虱MED隐种和MEAM1隐种、本地型烟粉虱AsiaⅡ1隐种以及温室粉虱Trialeurodes vaporariorum (Westwood)基因组DNA中热激蛋白基因hsp70和hsp90的拷贝数。【结果】不同种类的粉虱和烟粉虱不同隐种体内的hsp70和hsp90的含量均有较大差异,其中hsp70和hsp90拷贝数在入侵型烟粉虱MED和MEAM1隐种中含量较其他两种均高,而在土著种AsiaⅡ1隐种中含量最低,在温室粉虱中居中。此外,相同物种雌雄成虫hsp70和hsp90的拷贝数也不同,雌虫hsp70和hsp90拷贝数约为雄虫的2倍。【结论】不同种粉虱及烟粉虱不同隐种的hsp70和hsp90的拷贝数可能与其耐热性差异相关。本研究为解释不同种粉虱、烟粉虱不同隐种及其不同性别的耐热性差异机制提供了进一步的依据。     

内共生菌Cardinium对烟粉虱MED隐种耐药性的影响

【目的】次生内共生菌感染可影响烟粉虱Bemisia tabaci对杀虫剂的敏感性。本研究旨在揭示内共生菌Cardinium感染对烟粉虱B. tabaci MED隐种耐药性的影响。【方法】室内测定海南陵水与山东寿光烟粉虱MED隐种种群内遗传背景一致的Cardinium感染与未感染品系对不同浓度新烟碱类杀虫剂噻虫嗪和吡虫啉的耐药性。【结果】各浓度噻虫嗪和吡虫啉处理后,烟粉虱陵水种群感染Cardinium品系死亡率比未感染品系显著降低;100, 150, 175和200 mg/L噻虫嗪以及175和200 mg/L吡虫啉处理后,烟粉虱寿光种群感染Cardinium品系死亡率比未感染品系显著上升。相对于未感染品系,烟粉虱陵水种群感染Cardinium品系对噻虫嗪、吡虫啉的抗性倍数(RR)分别是1.355和1.847,烟粉虱寿光种群感染Cardinium品系的RR分别是0.790和0.847。【结论】内共生菌Cardinium感染能影响烟粉虱MED隐种对噻虫嗪和吡虫啉的耐药性,且这种影响在不同种群间存在差异。研究结果对于揭示烟粉虱MED隐种的种群适应性及扩张机制具有重要参考价值。     

烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒上传播番茄褪绿病毒的特性

【目的】分析与比较烟粉虱Bemisia tabaci MEAM1和MED成虫在辣椒Capsicum annuum植株上对番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)的传播差异,解析媒介昆虫-病毒-寄主植物间的互作关系,为田间辣椒上ToCV防治提供参考。【方法】利用烟粉虱MEAM1和MED成虫及ToCV cDNA侵染性克隆,对烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒植株上获取和传播ToCV的能力进行比较,同时比较烟粉虱MEAM1和MED成虫在健康和携带ToCV辣椒植株上的取食偏好。【结果】在感染ToCV的辣椒植株上接虫后96 h内,烟粉虱MEAM1和MED成虫体内病毒积累量逐渐增加,MED成虫获毒速度和病毒积累量均大于MEAM1成虫的,MED成虫获毒量是MEAM1成虫的1.74倍;MED成虫在辣椒植株上的传毒量明显高于MEAM1成虫,传毒量平均相差9倍,且MED成虫传毒率比MEAM1成虫高29%。MEAM1和MED成虫对健康和感染ToCV的辣椒植株的取食偏好相似,都明显倾向于取食被ToCV侵染的辣椒植株。【结论】烟粉虱MED成虫在辣椒植株上获取、传播ToCV的能力均高于烟粉虱MEAM1成虫,这也是ToCV在我国大面积发生的一个重要原因。     

番茄褪绿病毒对MED烟粉虱成虫在不同寄主植物上的寄主选择性和取食行为的影响

【目的】由粉虱传播的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)具有较强的暴发性和流行性,目前该病毒现已蔓延至世界各地,可为害多种作物,对农林经济生产造成严重危害。病毒侵染会影响介体昆虫的寄主选择性和取食行为,从而影响病毒传播。本研究旨在明确ToCV对MED烟粉虱Bemisiatabaci在不同寄主上的寄主选择性及取食行为的影响。【方法】利用Y型嗅觉仪测定携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫的寄主选择性,利用刺吸电位(electrical penetration graph, EPG)技术比较携带和未携带ToCV的烟粉虱雌成虫在健康的番茄、辣椒、棉花和豇豆4种寄主植株上的取食行为差异。【结果】未携带ToCV的MED型烟粉虱雌成虫对于4种寄主植物的选择偏好性排序为番茄、辣椒＞棉花＞豇豆;携带ToCV烟粉虱雌成虫对4种寄主植物的选择性偏好性降低,排序为番茄、辣椒、棉花＞豇豆。与未携带ToCV烟粉虱雌成虫相比,携带ToCV烟粉虱雌成虫取食4种植物所产生的刺探次数均显著增加,第1次到达韧皮部的时间有明显延后,取食总时间与韧皮部的取食时间明显减少。【结论】ToCV使烟粉虱对寄主的选择偏好性和取食行为发生显著改变,从而增加了病毒在寄主植物间传播的可能。     

西花蓟马诱导的番茄植株防御反应对B型烟粉虱行为的影响

【目的】明确外来入侵害虫西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)取食诱导的番茄植株防御反应对B型烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) B-biotype行为的影响, 探讨西花蓟马与B型烟粉虱的种间竞争机制。【方法】利用“Y”型嗅觉仪行为分析法、 选择性试验法, 研究了不同处理组合（健康植株CK vs烟粉虱为害植株B、 健康植株CK vs西花蓟马为害植株F、 烟粉虱为害植株B vs烟粉虱和西花蓟马共同为害植株B+F）下, 烟粉虱对不同处理植株的取食行为反应及寄主偏好的差异性, 并利用GC-MS分析了不同处理植株挥发性物质的差异性。【结果】“Y”型嗅觉仪行为分析结果表明, 在CK vs B和CK vs F两个组合中, 烟粉虱雌成虫对健康植株和昆虫为害植株的偏好性差异不显著; 而在B vs B+F组合中, 烟粉虱为害株对烟粉虱雌成虫具有极显著的引诱作用（P<0.01）。选择性试验结果表明, 在CK vs B和CK vs F这两个组合中, 烟粉虱成虫均偏好健康株并喜好在其上产卵（P<0.01）, 在B vs B+F组合中, 烟粉虱成虫偏好烟粉虱单独为害株并喜好在其上产卵（P<0.01）。GC-MS分析结果显示, 本实验收集到9种挥发性物质, 其中有5种烯萜类物质, 其相对含量高达90%以上。与烟粉虱单独为害株相比, 烟粉虱和西花蓟马共同为害株所释放的挥发性物质中, 对烟粉虱具有排斥作用的β-水芹烯显著升高, 而对其具有吸引作用的β-月桂烯却显著减少。【结论】综合分析认为, 西花蓟马诱导的番茄植株防御反应可以显著影响B型烟粉虱的寄主选择行为及产卵选择性。     

普通大蓟马聚集信息素的分离和鉴定

【目的】普通大蓟马Megalurothrips usitatus是我国华南地区重要的豆科害虫,给我国豇豆种植产业带来巨大损失。开发利用基于聚集信息素的引诱剂是普通大蓟马的绿色防控措施之一,对于普通大蓟马生物防治具有重要意义。【方法】采用Y型嗅觉仪测定普通大蓟马雌雄成虫对其雌虫和雄虫气味源的嗅觉反应;用顶空固相微萃取法(head space solid-phase microextraction, HS-SPME)和溶液浸提法提取普通大蓟马雌雄成虫挥发物;应用气质联用仪(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)对收集的气体挥发物和正己烷提取物进行活性成分分离鉴定;应用Y型嗅觉仪测定人工合成聚集信息素组分对雌雄成虫的引诱效果。【结果】行为学试验结果表明,普通大蓟马雄成虫气味源对其雌雄成虫均具有显著的引诱作用,而雌成虫气味源则没有。顶空固相微萃取法和溶液浸提法均可提取雄成虫挥发物主要组分,但顶空固相微萃取法获得的TIC图基线平稳,杂峰少,提取效果优于溶剂浸提法。GC-MS分析结果表明,普通大蓟马雄成虫挥发物中主要含有 1种化合物,为反式,反式-金合欢醇乙酸酯［(E,E)-farnesyl acetate］,该化合物在雌成虫挥发物中不存在。室内行为学实验结果表明,特定剂量的人工合成的(E,E)-farnesyl acetate对普通大蓟马雌雄成虫均具有显著的引诱作用。【结论】本研究证明了普通大蓟马雄成虫可以释放聚集信息素,并鉴定了其主要组分(E,E)-farnesyl acetate,为应用聚集信息素开展普通大蓟马的监测和诱杀提供了基础。