红莲型细胞质雄性不育性与线粒体渗透性转换

以水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)的不育系粤泰A(YTA)、保持系粤泰B(YTB)以及杂种F1代红莲2号(HL2)的黄化苗为材料,研究了在不同pH及离子强度下线粒体渗透性转换(MPT)的发生及其差异。结果表明,YTA、YTB和HL2间MPT的发生均存在差别,不育系YTA线粒体渗透性转换孔(PTP)的开启与关闭对pH及离子强度的变化较保持系YTB和HL2敏感。HL2与YTA虽然具有相同的细胞质来源,但两者之间PTP及MPT的特性明显不同,前者MPT的变化与具有正常生理功能的YTB线粒体的PTP和MPT的发生特点与特性相似。这些说明红莲型水稻细胞质雄性不育的发生可能与其MPT的发生有关。     

RAPD标记鉴定水稻3种不同细胞质雄性不育类型的杂交种及其亲本

利用RAPD引物对3种不同细胞质雄性不育类型的杂交水稻组合及其亲本共21个材料进行了DNA多态性分析。从264个随机引物中筛选出具有非常明显多态性的引物25个, 对25个引物在3种不同细胞质不育类型的杂交组合及其亲本间的DNA扩增多态性差异进行比较,最终选出具有不同类型间特异性扩增带的引物7个,利用这些特异性扩增带能有效地区分和鉴定目前在生产上大面积种植和推广,或者是具有应用潜力的3种不同细胞质雄性不育类型—野败型(WA)、红莲型(HL)和包台型(BT))—的6种杂交水稻组合及其亲本。     

水稻红莲型细胞质雄性不育系与保持系mtRNA差异显示和差别片段的分析

将T4 RNA连接酶和AFLP技术特点相结合构建了适于mtRNA的差异显示方法 ,并比较了水稻 (OryzasativaL .)红莲型细胞质雄性不育系、保持系和杂种一代mtRNA的差异。在 4组引物对的选择扩增产物中共找到 6个差异片段 ,其中差异条带DTA为不育系仅有 ,条带DAB为不育系和保持系特有 ,而条带DBF1、DBF2 、DBF3 、DBF4 为保持系和F1杂种共有。这表明水稻红莲型不育系粤泰A与杂种一代泰优 2号mtRNA的差异大于保持系粤泰B和杂种一代泰优 2号mtRNA的差异。Northern杂交证实条带DTA在不育系、保持系和杂种一代的转录确有差异 ,表明它与红莲型细胞质雄性不育有关。条带DTA全长 2 5 9bp ,尽管未发现有同源序列和新的开放阅读框 ,但它可作为探针从cDNA文库中筛选全基因序列 ,进而寻找与细胞质雄性不育有关的开放阅读框架。     

水稻孢子体细胞质雄性不育系线粒体DNA的RAPD分析

利用200个10nt随机引物对水稻孢子体细胞质雄性不育系珍汕97A、保持系珍汕97B、F1代汕优63、恢复系明恢63和另一种孢子体细胞质雄性不育系马协A、保持系马协B、F1代马协63的线粒体DNA进行PCR扩增。在36℃的退火温度下,有132个引物扩增出了清晰的、重复性较好的条带。同一组合内的不育系同保持系、恢复系之间线粒体DNA随机引物扩增产物的多态性明显高于不育系与F1代。不育系与F1代线粒体DNA的扩增产物也存在多态性。一些特异性的差异片段可能与水稻CMS相关。     

红莲型和野败型水稻细胞质雄性不育系线粒体DNA(mtDNA)的比较研究

以水稻红莲型和野败型细胞质雄性不育系为材料,用不连续蔗糖梯度离心法提纯线粒体,以饱和酚-氯仿-异戊醇法抽提mtDNA。用琼脂糖电泳和电镜观察比较不育系mtDNA差异,发现不育系中有小分子mtDNA(即m_2和m_3),不同细胞质间的小分子mtDNA存在差异。在不育系与保持系间名为m_1的大分子mtDNA无差异;本文还研究了mtDNAm_1的理化性质。     

水稻红莲型不育系雄性配子发育过程中线粒体功能基因转录本的编辑位点研究

RNA编辑普遍存在于高等植物线粒体中,是线粒体产生功能蛋白所必不可少的过程。以红莲(HL)型水稻细胞质雄性不育系粤泰A、保持系粤泰B及杂种红莲优6四分体时期的花药、单核花粉和二核花粉为材料,研究了线粒体功能基因———atp6、coxⅡ及嵌合基因orfH79转录本的编辑位点。结果表明,atp6转录本的编辑能力明显受到恢复基因的影响。atp6转录本在不育系中不被编辑或部分编辑,而在引入了恢复基因的杂种一代中,其编辑能力均大幅提高。coxⅡ转录本在3个材料中编辑状态没有差别,而嵌合基因orfH79在各个材料中均不被编辑。由此推测,红莲型水稻细胞质雄性不育与atp6转录本编辑能力的基本丧失紧密相关。     

红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体atp6基因转录本的编辑位点研究

以红莲(HL)型水稻细胞质雄性不育系A、保持系B及杂种一代F1为材料,首次比较研究了红莲型水稻线粒体atp6基因转录本的编辑位点及各位点的编辑频率.结果表明atp6基因的转录本有18个编辑位点,其中有15个发生在密码子的第一和第二位点上,这些位点的编辑最终会导致氨基酸种类的变化.18个编辑位点在A、B和F1中没有差异,但各位点的编辑频率在引入了核恢复基因的条件下发生了较大的变化,完全编辑的比例增加.这些结果首次证明HL型细胞质雄性不育与线粒体atp6转录本的编辑有一定相关性,编辑不充分的转录产物最终会干扰线粒体功能的正常发挥.     

三例小麦细胞质雄性不育系线粒体DNA的扩增片段长度多态性分析

细胞质雄性不育是小麦杂种优势利用的重要途径,为了鉴定3例小麦雄性不育系的细胞质类型,对其线粒体DNA(mtDNA)进行扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)分析。文中利用差速离心法和不连续蔗糖密度梯度超速离心法提取纯化小麦线粒体。结果表明:通过该提取方法获得的mtDNA,其质量和纯度能够满足PCR反应和遗传学分析。在64对选扩引物中,筛选到了4对特异性引物,其中引物E1/M7在ms(Kots)-90-110不育系扩增出3条特异条带;引物E4/M2在ms(Ven)-90-110不育系扩增出2条特异条带;引物E7/M6在ms(S)-90-110不育系中扩增出2条特异条带;引物E6/M4在ms(Kots)-90-110不育系中扩增出2条特异条带。这些特异引物可以用来作为鉴定具有粘果山羊草Aegilops kotschyi、偏凸山羊草Ae.ventricosa、斯卑尔脱小麦Triticum spelta 3类不育细胞质型小麦雄性不育系的细胞质分子标记,为研究小麦细胞质雄性不育机理奠定了分子基础。     

红莲型杂交水稻的研究与发展

1972年,武汉大学科研人员以红芒野生稻为母本,与江西地方品种莲塘早父本杂交,在后代中发现了雄性不育株.再用莲塘早多代回交,于1974年获得了不育性稳定的株系,命名为红莲型细胞质雄性不育系(Honglian-type cytoplasmic male sterility,HL-CMS),莲塘早为其保持系,红莲型细胞质雄性不育水稻由此问世.与单核期花粉败育的野败型水稻不同,红莲型属于二核期配子败育类型,花粉碘染为圆败,是杂交水稻新质源.40年来,武汉大学科研人员将基础研究、应用研究和产业化紧密结合,促进了红莲型杂交水稻的发展.分子功能验证发现,不育系线粒体内一编码79个氨基酸的可读框OrfH79为HL-CMS不育基因,ORFH79蛋白破坏线粒体正常功能后导致花粉败育.遗传分析发现,HL-CMS为双基因恢复模式,进而克隆了恢复基因Rf5和Rf6.育性恢复机理研究表明,恢复基因RF5蛋白与GRP蛋白互作,组装成400~500kD的分子复合体作用于atp6-OrfH79 mRNA,从而恢复不育性.借助分子标记辅助选择技术,创制出新的CMS和多基因恢复水稻材料,并用于育种实践,选育出高产优质红莲型杂交水稻新组合红莲优6号、珞优8号和粤优9号等,相继通过了湖北省、广西省和农业部国家农作物品种审定委员会等审(认)定,构建的红莲型杂交水稻亲本繁殖提纯体系突破了产业化瓶颈.当前,红莲型杂交水稻在中国长江流域、华南稻区已大面积种植,在越南、印度尼西亚、马来西亚、孟加拉和菲律宾等东南亚国家也表现优异,展现出广阔的应用前景.     

杂交水稻及其“三系”线粒体DNA的AP—PCR指纹图谱

为了研究水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）细胞质雄性不育（ＣＭＳ）与线粒体基因组的关系,应用ＡＰ－ＰＣＲ 分析,用７ 个任意单引物对６ 种水稻品系线粒体ＤＮＡ 进行了扩增。水稻线粒体ＤＮＡ 的ＡＰ－ＰＣＲ 产物可分为三种类型：（１）所有供试品系均能扩增的片段,它们代表了线粒体ＤＮＡ 在进化上的保守性序列。有４ 个引物检测到这类片段。（２）２ 个以上水稻品系共同出现而在全部供试材料间存在差异的扩增片段,这类片段是检测水稻线粒体ＤＮＡ多态性的主要来源。（３）一种细胞质类型所特有的扩增片段,从引物Ｒ２ 和Ｖ５ 的扩增产物中发现了这类片段,它们可能与ＣＭＳ有关联。另外,ＷＡ型不育系珍汕９７Ａ 与其杂种之间在６ 个引物的扩增图谱上均存在不同程度的差异,说明两者的线粒体ＤＮＡ序列结构可能存在某种差别     

Mitochondrial Genome Fingerprinting in Hybrid Rice and Its Associated Lines Using the Primed Polymerase Chain Reaction

A new economic and efficient DNA polymorphism assay was developed in 1990 that is based on the amplification by polymerase chain reaction (PCR) of random DNA segments using primers of arbitrary nucleotide sequence. Authors have now adapted this type of amplification to rice mitochondrial genome. Using 6 rice varieties in conjunction with 7 of 20–27 mer oligonucleotide primers, the AP-PCR products revealed that the amplified DNA bands fell into two categories, the evolutively conserved the cytoplasmic-specific. It is suggested that AP-PCR assay of mtDNA may help to classify or identify the cytoplasms in rice. By comparing "fingerprints" among the WA type cytoplasmic male sterility (CMS) rice, its Maintainer and Restorer lines, as well as its hybrid, one CMS cytoplasm-specific band (primer R2/630 bp) and one normal cytoplasm-specific segment (primer V5/707 bp) could be directly identified among the set of amplified DNA fragments. Further, some difference in the amplification patterns of mtDNA between CMS line and its hybrid, which infers that rearrangement of mitochondrial genome in hybrid rice probably happened.     

红莲型杂交稻(红莲2号)及其骨干亲本的RAPD分析与鉴定

利用RAPD技术,从248个随机寡核苷酸引物（10－mer）中筛出18个引物对红莲型杂交稻组合红莲2号及其亲本（T－07A、T－07B、YD6－05）,另6个红莲型胞质不育系的骨干恢复和汕优63及其亲本共14份水稻材料进行分析。共检测到173个多态性标记。聚类分析结果表明：不育系与保持系间因核背景相似,遗传差异很小;杂种（F1）的基因型更倾向于恢复系;恢复系与保持系间遗传距离的相对较大,但各恢复系之间的遗传距离较小。利用这些标记能有效地地区交组合中不育系,保持系、恢复系和杂种（F1）。     

Catalytic assays in blue native gels revealed normal ATPase but deficient NADH dehydrogenase activity in ZidaoA CMS line of rice (<Emphasis Type="Italic">Oryza sativa</Emphasis>)

Cytoplasmic male sterility (CMS) is an important trait in rice (Oryza sativa L.) breeding because it provides a source for producing hybrid seeds. In rice CMS lines, ATPases involved in the oxidative phosphorylation complexes are believed to be dysfunctional due to the expression of rice CMS-related gene orf79. In the present study, a new type of CMS line named CMS-ZA (ZidaoA) was used. We found an orf79 homologous gene (named orfZ79) in three different rice lines (a CMS line, a maintainer line, and a hybrid). However, no detectable expression products of orfZ79 were found in the three lines. We evaluated the ATPase and NADH dehydrogenase activities of the three lines using in-gel catalytic assays. Our results show that the sterile line has intact ATPase activity, while NADH DHase activity is clearly decreased. To investigate NADH dehydrogenase deficiency, we measured NADH DHase activity in etiolated seedlings and green seedlings from the ZidaoA CMS sterile line and its corresponding maintainer line. We note that the NADH DHase activity of the sterile line was more deficient in green seedlings than that in etiolated seedlings. Our results show a possible role of NADH DHase deficiency to cause rice CMS.     

水稻CMS不育系细胞质遗传效应的研究进展

在三系杂交水稻生产中,不育系的细胞质对杂种一代的表现具有一定的效应。同一种不育细胞质对不同性状的效应是不同的;不同的不育细胞质对同一性状的效应也存在着差异;且对大多数性状表现为负向效应。可通过扩大不育细胞质源以选用优质细胞质或选用强优恢复系来减少或消除其负效应,培育同核异质的多胞质不育系来适应杂交水稻生产的需要。     

分子标记辅助选择改良水稻不育系臻达A及其杂交种的稻瘟病抗性

水稻抗稻瘟病基因Pi25是一个遗传传递能力强的广谱抗性基因。本研究以携带抗稻瘟病基因Pi25的BL27为抗源供体,与优质、配合力强、感稻瘟病的水稻保持系臻达B为受体亲本进行杂交、回交创制水稻抗病保持系新种质,再与臻达A测交和回交进行不育系转育,结合分子标记辅助选择和农艺性状筛选,获得3个抗性基因纯合、农艺性状和开花习性均与臻达A相似的改良不育系株系。利用福建省近年来致病性代表的22个稻瘟病菌株对3个改良不育系及其15个杂交种进行抗性鉴定,3个改良不育系的抗性频率为95.45%~100%,15个杂交种的抗性频率均达75%以上,而原始对照臻达A及其杂交种的抗性频率仅为54.55%和40.91%~63.64%。自然病圃诱发鉴定表明,3个改良不育系的叶瘟和穗颈瘟均为0级,表现高抗,而对照臻达A的叶瘟为5级,穗颈瘟为7级,表现感病;15个杂交种均表现良好的稻瘟病抗性。进一步分析比较15个杂交种的产量、农艺性状和稻米品质表现,结果表明臻达A-Pi25-3改良不育系的综合性状表现最优,继续回交转育,于2015年育成了稻瘟病抗性强、配合力好、群体整齐和性状稳定的不育系,命名为157A。研究表明,抗稻瘟病基因Pi25不仅在水稻不育系臻达A的遗传背景下的抗性表达完全,且在不同水稻恢复系测交种的背景下同样表现出较高水平的抗性,说明抗性基因Pi25对不育系稻瘟病改良的效果明显。创制的新不育系157A的稻瘟病抗性显著提高,还基本保留了原来不育系高配合力等优良特性,为选育高产、优质、抗病杂交稻新品种提供了不育系新种质。     

Classification of rice germplasm: III. High-resolution fingerprinting of cytoplasmic genetic male-sterile (CMS) lines with AFLP

 The cytoplasmic genetic male-sterile (CMS) lines developed at the International Rice Research Institute are valuable in producing tropical rice hybrids. Efficient use of CMS lines in hybrid rice production will depend on their level of genetic diversity. Aside from morphological characterization, molecular analysis based on DNA markers can provide information on the genetic diversity of the germplasm. The Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) technique was used to fingerprint 71 CMS lines and four rice cultivars, ‘IR64’, ‘Azucena’, ‘IR74’, and ‘FR13A’. Eleven primer pair combinations specific to the enzymes PstI and MseI were used to generate 530 AFLP markers, 176 of which were polymorphic. Each CMS line revealed a distinct fingerprint. The AFLP marker-based dendrogram depicted genetic variation among the CMS lines. The CMS lines developed in japonica background grouped with ‘Azucena’, a japonica cultivar. None of the CMS lines clustered with ‘FR13A’, a flood-tolerant traditional indica variety. ‘IR64’ was found to be distinct from the other indica CMS lines and clustered with lines developed in its background. The grouping of CMS lines into a few groups is useful for breeders in selecting genetically diverse CMS lines for hybrid rice production and in avoiding test crossing every CMS line empirically. This study demonstrated that AFLP is a powerful and reliable tool in determining the genetic relationships and in producing distinct fingerprints of rice cultivars. Received: 20 December 1996 / Accepted: 9 October 1997     

红莲型水稻与细胞质雄性不育相关mtDNA片段的分离及序列测定

应用AFLP分析技术,比较了红莲型水稻雄性不育系和保持系线粒体DNA,找到一不育系特异条带TA1。以该条带DNA为探针与不育系、保持系以及F1杂种线粒体总RNA杂交,结果显示该片段黄化苗期三者均转录一个RNA分子,但转录产物分子量各不相同,说明三者该片段阅读框架不同。经测序,该片段长202bp,序列内含密码子ATG、ATT、AGA、AGG以及正向重复序列5’TGTAC3’、5’ATTATTTT3’和倒重复序列5’GGGAAACA3’。上述特点表明该片段可能是某一蛋白编码序列,并可能与红莲型水稻雄性不育性状形成有关。