三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究 Ⅱ.三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的影响

本文报告了三尖杉酯碱对艾氏腹水癌和小鼠L_(1210)白血病细胞DNA聚合酶α的抑制作用。癌细胞破碎后,经超速离心,DEAE-纤维素和磷酸纤维素P_(11)柱层析部分纯化了DNA聚合酶α。该酶在1μM三尖杉酯碱存在时的抑制率为40%左右。在一定的三尖杉酯碱浓度范围内,酶的抑制率随药物浓度的增加而升高。经药物预保温的DNA,模板活性没有变化;而经药物预保温的酶,其活性受到了显著的抑制。当酶量或模板量固定不变时,则过量的模板或过量的酶均能降低药物的抑制率。上述结果初步表明三尖杉酯碱可能是酶的竞争性抑制剂。     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅲ.三尖杉酯碱抑制作用动力学及其衍生物作用的比较

本文报告了三尖杉酯碱抑制艾氏腹水癌细胞DNA聚合酶α的动力学。三尖杉酯碱的抑制作用与反应体系中的模板DNA量有关,过量的DNA可降低药物的抑制作用,但不能完全消除药物的抑制。并证明三尖杉酯碱与模板DNA对DNA聚合酶α是混合型抑制,当三尖杉酯碱浓度为10μM时,其K_i值为9.5μM,K_m值为13μg DNA/100μl。三尖杉酯碱抑制DNA聚合酶α的能力不受反应体系中四种脱氧核苷三磷酸底物浓度的影响,通过同时改变四种底物浓度,或固定三种底物浓度只改变其中一种底物的量,或采用限制性DNA合成系统(Limited DNA Synthesis)即在完全体系中省略去某一底物,均证明三尖杉酯碱与四种底物对DNA聚合酶α为非竞争性抑制,当三尖杉酯碱浓度为4μM时,对dCTP、dGTP和dTTP的K_i值分别为12μM、11μM和12μM。本文也比较了三尖杉酯碱衍生物——高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和表三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的抑制作用。结果表明,当药物浓度相同时,高三尖杉酯碱的作用较三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱强,而三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱的作用相近;表三尖杉酯碱本身对DNA聚合酶α无抑制作用,也未见其在无细胞系统中对三尖杉酯碱的抑制能力有加强作用。以上药物对E.coli DNA聚合酶Ⅰ也有相似的抑制作用。     

不同产地三尖杉中三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的含量测定

本文对三尖杉科(属)中的三尖杉Cephalotaxus fortunei Hook f.植物中所含抗白血病的三尖杉酯碱harringtonine与高三尖杉酯碱homoharringtonine作了不同产地和不同部位的含量测定。     

三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的生物活性及临床应用

概述了从粗榧料植物中分离的抗肿瘤生物碱三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱等的生物活性,包括其实验及临床药理、临床毒性、分子药理机制,化学研究和未来市场的研究展望。     

高三尖杉酯碱等四种药物的体外抑制乙肝病毒的实验研究

探讨高三尖杉酯碱、干扰素α1b、羟基喜树碱和诺氟沙星这四种药物对乙肝病毒的体外抑制作用。利用HBV全基因组转染的人肝癌细胞系(HepG2.2.15),采用CPE方法观察四种药物对HepG2.2.15的毒性大小,在最大无毒浓度下,将药物加入HepG2.2.15培养8天收集培养液,用ELISA法和荧光定量PCR法分别测定药物对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg及HBV-DNA的抑制作用。结果显示在体外高三尖杉酯碱和干扰素α1b对乙肝病毒均有明显的抑制作用,羟基喜树碱对乙肝病毒仅有一定的抑制作用,诺氟沙星则在各浓度均未见对乙肝病毒有抑制作用。本实验证实了高三尖杉酯碱在体外对乙肝病毒有明显的抑制作用,为临床抗乙肝药物的研究提供了一定的理论依据。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究 Ⅰ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含DNase、RNase 和蛋白酶活力,无内源DNA。测定了 RNA 聚合酶A和C对α-鹅膏荤碱的敏感性。酶A在α-鹅膏荤碱为400μg/ml时,活性受到抑制,而酶C在该浓度时,几乎不受抑制。(NH_4)_2SO_4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40mM和240mM。无二价金属离子Mn~(2+)或Mg~(2+),酶A和C几乎无活力。两种酶最适Mn~(2+)浓度均为2.5mM,Mg~(2+)浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

高三尖杉酯碱等四种药物的体外抑制乙肝病毒的实验研究

探讨高三尖杉酯碱、干扰素α1b、羟基喜树碱和诺氟沙星这四种药物对乙肝病毒的体外抑制作用.利用HBV全基因组转染的人肝癌细胞系(HepG2.2.15),采用CPE方法观察四种药物对HepG2.2.15的毒性大小,在最大无毒浓度下,将药物加入HepG2.2.15培养8天收集培养液,用ELISA法和荧光定量PCR法分别测定药物对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg及HBV-DNA的抑制作用.结果显示在体外高三尖杉酯碱和干扰素α1b对乙肝病毒均有明显的抑制作用,羟基喜树碱对乙肝病毒仅有一定的抑制作用,诺氟沙星则在各浓度均未见对乙肝病毒有抑制作用.本实验证实了高三尖杉酯碱在体外对乙肝病毒有明显的抑制作用,为临床抗乙肝药物的研究提供了一定的理论依据.     

高三尖杉酯碱对兔红细胞膜钙调蛋白的抑制作用

本实验显示高三尖杉酯碱能在>5μg/ml浓度以上抑制兔红细胞膜上钙调蛋白活性(P<0.05).推测高三尖杉酯碱能通过影响癌细胞钙调蛋白活性干扰细胞钙代谢和减少阿霉素和长春新碱的抗药性.     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅰ.对DNA模板及其合成代谢的影响

本文应用吸收光谱移动法、萤光光谱移动法、~(3)H-药物与DNA 结合实验以及~(3)H-胸腺嘧啶核苷连续标记技术研究了三尖杉酯碱抑制L_(1210)细胞DNA 生物合成的机制。结果表明,DNA合成的受抑可能是由于该药干扰其代谢过程而非直接损伤其模板所致。     

沉默MDR1基因可增强三尖杉酯碱诱导的SGC7901/ADM细胞凋亡

为探讨沉默MDR1基因对三尖杉酯碱诱导SGC7901/ADM细胞凋亡的影响,将本实验室构建的靶向MDR1基因的RNAi干扰载体pSilencer 2.1-3,转染胃癌SGC7901/ADM细胞,经三尖杉酯碱处理后,通过MTT法检测细胞活力,激光共聚焦显微镜和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡现象。研究发现,pSilencer 2.1-3稳定转染SGC7901/ADM细胞后,三尖杉酯碱对细胞的IC_950)值由(2.527±0.316)μg/m L降至(0.719±0.087)μg/mL,相对逆转率达到(72.435±2.921)%,从而提高了SGC7901/ADM细胞对三尖杉酯碱的敏感性。激光共聚焦显微镜下,细胞形态发生改变,染色质凝聚、边缘化,琼脂糖凝胶电泳DNA呈梯状条带,呈现明显的凋亡特征,结果表明,沉默MDR1基因增强了三尖杉酯碱诱导的SGC7901/ADM细胞凋亡。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究I．酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B一12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含Dnase、Rnas：和蛋白酶活力,无内源．DNA。测定了RNA聚合酶A和c对弘鹅膏蕈碱的敏感性。酶A在a-鹅膏荤碱为400μg／ml时,活性受到抑制,而酶c在该浓度时,几乎不受抑制。(NH4)zSO4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40raM和240raM。无二价金属离子Mn+或Mg2+,酶A和c几乎无活力。两种酶最适Mn2+浓度均为2.5mM,Mg2+浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

高三尖杉酯碱对HL60细胞诱导分化与对细胞膜通道影响相互关…

本实验显示,高三尖杉酯碱能使人白血病ＨＬ６０细胞诱导分化,随着药物浓度的增加,细胞诱导分化率亦明显增加,高三尖杉酯碱能抑制细胞膜Ｎａ＾＋,Ｋ＾＋ＡＴＰ酶活性,并能增加胸腺嘧啶核苷进入细胞,这些均可有是高三尖杉酯碱产生诱导分化的途径。     

高三尖杉酯碱对HL_(60)细胞诱导分化与对细胞膜通道影响相互关系的研究

本实验显示,高三尖杉酯碱能使人白血病HL_(50)细胞诱导分化。随着药物浓度的增加。细胞诱导分化率亦明显增加。高三尖杉酯破能抑制细胞膜Na~ ,K~ ATP酶活性(IG_(50)值为156±27μm),并能增加胸腺嘧啶核苷([~3H]TdR)进入细胞。这些均可能是高三尖杉酯碱产生诱导分化的途径。     

锂和三尖杉酯碱对HL—60细胞增殖,分化和c—myc表达的影响

本研究利用细胞培养技术观察了氯化锂和三尖杉酯碱（ＨＴ）对ＨＬ－６０细胞增殖的影响,不同浓度的氯化锂对ＨＬ－６０细胞的集落形成和３Ｈ－ＴｄＲ参入均呈剂量依赖式抑制;三尖杉酯碱亦有类似的作用。在培养体系中加氯化锂和三尖杉酯碱时,对ＨＬ－６０细胞数及集落形成抑制作用与单用二者相比较有明显增加。用ＮＢＴ还原试验,氯化锂和三尖杉酯碱均促进ＨＬ－６０细胞的分化,小剂量氯化锂还能加强三尖杉酯碱对ＨＬ－６０细胞诱导分化作用。从氯化锂和三尖杉酯碱处理的ＨＬ－６０细胞中提取总ＲＮＡ,应用ＲＴ／ＰＣＲ检测ｃ－ｍｙｃ的表达,结果表明经氯化锂和三尖杉酯碱处理的ＨＬ－６０细胞ｃ－ｍｙｃ表达均降低,与未处理的ＨＬ－６０细胞ｃ－ｍｙｃ比较,说明氯化锂和三尖杉酯碱均能抑制ｃ－ｍｙｃ的表达,提示ｃ－ｍｙｃ很可能在白血病细胞增殖、分化中起调控作用。     

三尖杉酯碱对白血病L-1210细胞杀伤动力学研究 Ⅰ.放射自显影观察

以放射自显影的方法研究了三尖杉酯碱对小鼠L-1210白血病细胞的杀伤动力学。三尖杉酯碱20微克/只腹腔注入后3小时,部分腹水细胞出现明显的核损伤,如核碎裂,而胞质的损伤则不明显。以~3H-TdR脉冲标记后0.5小时腹腔注入三尖杉酯碱20微克/只,损伤的标记细胞在给药后5小时为26.1%,损伤的非标记细胞占11.9%,标记指数也随给药而逐时下降,到24小时由对照的28.9%下降到4.6%。给药后3～9小时有丝分裂指数明显下降。以~3H-TdR进行脉冲标记后,用秋水仙酰胺阻断,再给三尖杉酯碱30微克/只,观察标记有丝分裂指数的变化,发现药物强烈抑制S期细胞进入M期。药物杀伤结合秋水仙酰胺抑制实验证明,给药时正处于M期的细胞仍可继续完成分裂,而G_3期细胞进入M期明显受到抑制。连续16小时腹腔注射5微居里/只后,不标记的G_0期细胞占52.3%,此时注射三尖杉酯碱后5小时G_0期细胞的损伤达19.7%。体内、体外试验发现三尖杉酯碱对~3H-TdR、~3H-L-门冬酰胺的参入有明显抑制,在给药后0.5小时即下降至最低点,并持续12～48小时才恢复正常。药物对~3H-TdR参入的抑制与细胞的平均标记颗粒数的减少存在平行关系。根据以上结果认为三尖杉酯碱系属细胞周期非特异性药物,但对S期细胞杀伤较明显。     

三尖杉酯碱对白血病L-1210细胞杀伤动力学研究 Ⅰ.放射自显影观察

以放射自显影的方法研究了三尖杉酯碱对小鼠L-1210白血病细胞的杀伤动力学。三尖杉酯碱20微克/只腹腔注入后3小时,部分腹水细胞出现明显的核损伤,如核碎裂,而胞质的损伤则不明显。以~3H-TdR 脉冲标记后0.5小时腹腔注入三尖杉酯碱20微克/只,损伤的标记细胞在给药后5小时为26.1%,损伤的非标记细胞占11.9%,标记指数也随给药而逐时下降,到24小时由对照的28.9%下降到4.6%。给药后3～9小时有丝分裂指数明显下降。以~3H-TdR 进行脉冲标记后,用秋水仙酰胺阻断,再给三尖杉酯碱30微克/只,观察标记有丝分裂指数的变化,发现药物强烈抑制S 期细胞进入M 期。药物杀伤结合秋水仙酰胺抑制实验证明,给药时正处于M 期的细胞仍可继续完成分裂,而G_2期细胞进入M 期明显受到抑制。连续16小时腹腔注射5微居里/只后,不标记的G_0期细胞占52.3%,此时注射三尖杉酯碱后5小时G_0期细胞的损伤达19.7%。体内、体外试验发现三尖杉酯碱对~3H-TdR、~3H-L-门冬酰胺的参入有明显抑制,在给药后0.5小时即下降至最低点,并持续12～48小时才恢复正常。药物对~3H-TdR 参入的抑制与细胞的平均标记颗粒数的减少存在平行关系。根据以上结果认为三尖杉酯碱系属细胞周期非特异性药物,但对S 期细胞杀伤较明显。     

三尖杉酯碱对小鼠L_(1210)瘤细胞作用的超微结构研究

1.本文描述了三尖杉酯碱对小鼠L_(1210)腹水瘤细胞超微结构的影响。瘤细胞主要是以“凋落”(Apoptosis)的形式裂解死亡。并观察和讨论了这种坏死细胞的形态变化过程。2.三尖杉酯碱引起瘤细胞有丝分裂减少,从超微结构的变化分析,可能是由于药物引起分裂间期细胞的损伤,从而使进入分裂期的细胞数减少。3.通过观察三尖杉酯碱对瘤细胞超微结构的作用,我们对药物作用的原理进行了讨论,初步认为它可能是直接对核酸的结构与代谢发生作用,但也不能排除对蛋白质代谢的干扰。4.实验组细胞中A型病毒颗粒的减少,可能主要是瘤细胞受到药物的破坏,而间接影响了病毒的正常复制。     

抗癌植物篦子三尖杉(Cephalotaxus oliveri Mast.)的研究

从广东产的篦子三尖杉(Cephalotaxus olivert Mast.)中分离出三种生物碱:三尖杉酯碱(harringtonine)、三尖杉碱(cephalotaxine)、schelhammera alkaloid B。其中,三尖杉酯碱在1毫克/公升的剂量下,对小鼠肉瘤 S_(180)的抑制率为42.3%。临床试用,对急性非淋巴型白血病有较好的疗效。我国的篦子三尖杉资源比较丰富,抗癌有效成份三尖杉酯碱的得率较高,达1.3/万,是生产三尖杉酯碱的好原料。     

高三尖杉酯碱对核仁的作用和心肌毒性的电子显微镜研究

高三尖杉酯碱(高杉)为治疗白血病有效药物。在超显微结构的研究中发现它除了产生一般性的细胞损伤外,还能选择性地对核仁产生刺激作用,见到核仁增大及增多。我们应用电子显微镜对肝细胞作定量观察,测定单位核体积所含核仁体积(Nu/N)的结果显示:用高杉1.5毫克/公斤腹腔注射20小时后,Nu/N显著增大,几乎为对照组肝细胞核仁的三倍,具体数值分别为0.14±0.02和0.05±0.01,统计学测验相差非常显著。同时实验组核仁数目也较对照肝细胞增加一倍左右,后者平均每核含有1.76个核仁,前者则为3.08,差别也显著。由于核仁是rRNA前体的合成部位,当核糖体蛋白质合成受抑制时,往往会经反馈作用引起核仁代偿性增大。因此,结合高三尖杉酯碱生化作用的研究,认为它可能是因为抑制了核糖体的蛋白质合成起始部位,从而导致核仁刺激作用。同时还定量分析了高三尖杉酯碱对核被表面积和厚度的影响,未见显著作用。在临床及动物实验中可见到,用高三尖杉酯碱治疗会发生心率不齐或心电图异常等变化。我们研究了它对小鼠心肌亚显微结构的变化,发现在注射1.5毫克/公斤后20小时小鼠心肌原纤维溶解,核质疏松、线粒体肿胀和肌浆网扩张等现象,如剂量增至3毫克/公斤时,Z带密度下降,局部断裂甚至消失,线粒体嵴也有些损伤。同时用另一对心脏有影响的抗癌药柔红霉素作比较,在等毒性剂量下(2.5与5毫克/公斤)所起的影响比高三尖杉酯碱严重得多。在高剂量组(5毫克/公斤)可产生空斑、肌纤维严重稀疏、线粒体破碎,Z带损伤,肌细胞广泛空泡化现象,毛细血管或细胞间质中出现纤维样物质等。这些变化可以说明临床和实验治疗所观察到的心肌毒性表现。     

高三尖杉酯碱对核仁的作用和心肌毒性的电子显微镜研究

高三尖杉酯碱(高杉)为治疗白血病有效药物。在超显微结构的研究中发现它除了产生一般性的细胞损伤外,还能选择性地对核仁产生刺激作用,见到核仁增大及增多。我们应用电子显微镜对肝细胞作定量观察,测定单位核体积所含核仁体积(Nu/N)的结果显示:用高杉1.5毫克/公斤腹腔注射20小时后,Nu/N 显著增大,几乎为对照组肝细胞核仁的三倍,具体数值分别为0.14±0.02和0.06±0.01,统计学测验相差非常显著。同时实验组核仁数目也较对照肝细胞增加一倍左右,后者平均每核含有1.76个核仁,前者则为3.08,差别也显著。由于核仁是rRNA 前体的合成部位,当核糖体蛋白质合成受抑制时,往往会经反馈作用引起核仁代偿性增大。因此,结合高三尖杉酯碱生化作用的研究,认为它可能是因为抑制了核糖体的蛋白质合成起始部位,从而导致核仁刺激作用。同时还定量分析了高三尖杉酯碱对核被表面积和厚度的影响,未见显著作用。在临床及动物实验中可见到,用高三尖杉酯碱治疗会发生心率不齐或心电图异常等变化。我们研究了它对小鼠心肌亚显微结构的变化,发现在注射1.5毫克/公斤后20小时小鼠心肌原纤维溶解,核质疏松、线粒体肿胀和肌浆网扩张等现象,如剂量增至3毫克/公斤时,Z 带密度下降,局部断裂甚至消失,线粒体嵴也有些损伤。同时用另一对心脏有影响的抗癌药柔红霉素作比较,在等毒性剂量下(2.5与5毫克/公斤)所起的影响比高三尖杉酯碱严重得多。在高剂量组(5毫克/公斤)可产生空斑、肌纤维严重稀疏、线粒体破碎,Z 带损伤,肌细胞广泛空泡化现象,毛细血管或细胞间质中出现纤维样物质等。这些变化可以说明临床和实验治疗所观察到的心肌毒性表现。