急性低氧对小鼠黏附分子CHL1组织水平表达的影响

目的:观察急性低氧条件下小鼠脑组织及心、肺、肾中黏附分子CHL1的表达变化,为探讨黏附分子CHL1在低氧损伤中的调节作用提供依据.方法:利用本室已建立的小鼠急性低氧模型,将雄性成年C57BL/6小鼠随机分为低氧处理组和常氧对照组(n=10).低氧8h后提取组织蛋白,通过Westem blot检测急性低氧处理后CBL1在...     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29～31kb.基因组从5′到3′端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1].     

CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达

目的：研究CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达。方法：以质粒pBS1761为模板扩增TAP-tag片段,PCR产物经纯化后克隆在真核表达载体pTRE2-hyg上。再以pUK-CPSF30k、73k、100k为模板扩增CPSF基因片段,将其克隆在质粒pTRE2-hyg-TAP-tag中TAP-tag片段的下游,并将重组质粒转化入细胞株Hela Tet-offS3细胞内。结果：细胞抽提液经SDS PAGE电泳后进行蛋白质印迹杂交,胶片上出现野生型的CPSF条带和分子量较大的滞后条带。后者经分子量与分子标记对照,确系重组体TAP-tag-CPSF所表达的蛋白条带。结论：重组质粒pTRE2hyg-TAP-tag-CPSF30k,73k,100k在Hela tet-offS3内完好表达。     

mbr-FPGS高效表达质粒增强Jurkat细胞对甲氨蝶呤的敏感性

叶酰多聚谷氨酸盐合成酶(Folylpolyglutamate synthetase,FPGS)是将化疗药物甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)转化成甲氨蝶呤多聚谷氨酸盐(MTXPG)的关键酶,其表达水平直接影响肿瘤细胞对MTX敏感性。与B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)相比,T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞中FPGS表达水平低,因此对MTX不敏感。本实验室前期研究证实,位于BCL2基因3′-UTR区的一段长279 bp的DNA序列mbr具有显著的增强子效应。文章构建了含有mbr增强子样序列的FPGS表达质粒,用其转染Jurkat细胞后,分别以Westernblotting和MTT法检测FPGS表达水平及MTX对肿瘤细胞的抑制率。结果表明mbr能够显著提高FPGS表达质粒的表达水平,并有效增强Jurkat细胞对MTX的敏感性。这一结果为将基础研究结果应用于临床、提高MTX对T-ALL细胞的化疗疗效提供了新的思路。     

过表达bFGF促进大鼠急性缺血心肌的毛细血管生成

研究过表达人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）在大鼠急性心肌缺血模型中的表达及其对心肌血管 再生的影响. 将含人bFGF质粒pcDNA/b转染人脐带静脉内皮细胞（HUVEC） ,进行MTT检测. pcDNA/b转染人肾细胞293细胞系,进行G418稳定筛选, Western 印迹检测.建立大鼠急性心肌梗死模型,分别将生理盐水、空质粒 pcDNA3.1(+)和pcDNA/b分3点注射于梗死交界处心肌内4周后取材,做常规 HE 染色和Masson 染色,测量各组微血管数量和梗死面积. 经免疫组织化 学染色鉴定和电镜观察,过表达外源bFGF可以促进HUVEC（细胞）生长; pcDNA/b能在293细胞中高效表达外源bFGF基因. pcDNA/b注射组梗死交界处 可见大量新生血管,毛细血管总数明显大于对照组,梗死面积明显小于对 照组. pcDNA/b组在梗死交界区有bFGF阳性表达.电镜观察显示,在梗死交界 处心肌细胞间有毛细血管增生,分化成2个血管腔.本实验证明,过表达bFGF 具有促进大鼠急性缺血心肌的毛细血管生成的作用,为bFGF基因治疗缺血 性心肌病的研究提供实验基础.     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29~31kb。基因组从5'到3'端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1]。编码复制酶蛋白的基因,从基因组5'端起约占全长的2/3区域(≈21.2kb),在该区域的nt13392-13398存在保守的UUUAAAC位点,此位点含有-1位的核糖体翻译移框(frameshift),可引发自单一起始位点的蛋白翻译扩展,即由ORF1a编码的Pp1a(约486kDa)扩展为由ORF1b编…     

慢性缺氧的猪肺动脉内皮细胞在急性缺氧时PDGF-B链mRNA的表达

采用原位杂交技术结合图象分析检测常氧(PO2±21.3kPa)及慢性缺氧(P025.3±0.7kPa)培养的猪肺动脉内皮细胞PDGF-BmRNA的表达及其对急性缺氧刺激的反应.结果常氧及慢性缺氧培养的肺动脉内皮细胞(PAEC)在急性缺氧后PDGF-BmRNA表达均增加(P＜0.05),以第4、6代慢性缺氧组升高的幅度更大.结果表明慢性缺氧可增强PAEC在急性缺氧时PDGF-BmRNA的表达,可能促进肺血管改建和肺动脉高压的发展.     

慢性阻塞性肺病患者急性加重期外周血IL-8、TNF-alpha及IGF-I表达变化 的意义

目的：研究慢性阻塞性肺病（COPD）患者急性加重期外周血白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）及胰岛素样生长 因子-I（IGF-I）表达变化的临床意义。方法：选取2013 年12 月-2014 年12月我院收治的COPD 急性加重患者100 例为观察组, 选取同期健康体检者100 例为对照组,检测观察组患者治疗前、治疗稳定后及对照组外周血IL-8、TNF-alpha及IGF-I水平。结果：观 察组患者治疗前外周血IL-8、TNF-alpha及IGF-I水平显著高于治疗稳定后,差异有统计学意义（P＜ 0.05）;观察组患者治疗稳定后外 周血IL-8、TNF-alpha及IGF-I水平显著高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：COPD 急性加重期外周血IL-8、TNF-琢及 IGF-I水平显著增高,治疗稳定后其水平显著降低,IL-8、TNF-alpha及IGF-I水平对COPD 的诊断和治疗具有重要意义。     

低氧运动后不同恢复环境腓肠肌热休克蛋白70表达变化

目的：实验旨在观察急性间歇低氧（氧含量12．7％）跑台运动后不同恢复环境下大鼠腓肠肌热休克蛋白HSP70表达的时程变化。方法：雄性sD大鼠进行低氧环境下的急性间歇跑台运动,用Western blot方法检测低氧运动后即刻、低氧运动后低氧恢复及常氧氧恢复1d,2d,7d的大鼠腓肠肌HSP70蛋白表达水平。结果：急性间歇低氧运动后即刻HSP70蛋白表达水平开始升高。常氧恢复第1dHSP70蛋白表达水平显著高于常氧对照组,P〈0．05。第2d、第7d呈现先降低后升高的趋势;低氧恢复中HSP70蛋白表达水平均显著高于常氧对照组,P〈0．05。结论：急性间歇低氧运动后能诱导HSP70蛋白表达水平升高;低氧恢复过程中HSP70蛋白高水平表达维持的时间要比常氧恢复长。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

大肠杆菌和酵母表达系统的研究进展

20世纪70年代以来,分子生物学及基因组学迅猛发展,其在生物及医学领域发挥着越来越重要的作用。在发酵工业中,分子生物学技术广泛应用于菌种的遗传改造和基因工程菌株的构建,以期提高发酵产物的产量并丰富发酵产物的类型。其中,利用原核及真核表达系统进行外源基因的扩增、表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和酶制剂等是近十年来发酵工业的新兴领域。本文从表达载体和宿主菌改造两方面综述近些年来大肠杆菌及酵母表达系统的新进展与新技术。     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达, 并简化质粒DNA的制备过程, 本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造, 为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5￠-和3￠-调控区切出, 同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体, 构建成另一输卵管特异表达载体pOV2; 将鸡卵清蛋白基因5￠-调控区单独克隆入同样载体, 获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性, 将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5'-调控区的下游, 获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后, 经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测, 结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达, 而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达, 而且表达的重组酶能分泌到蛋清中, 雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用, 其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明, 鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点, 能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

鹿茸富脯氨酸多肽-APRP基因融合表达载体的构建及表达

目的:构建鹿茸富脯氨酸多肽(APRP)基因融合表达载体,并诱导表达融合蛋白GST-APRP。方法:以鹿茸顶端组织总c DNA为模板,PCR方法扩增目的片段,连接p MDTM18-T载体,转化E.coli DH5α进行TA克隆。酶切与测序鉴定合格后,将目的片段与p GEX-6P-1质粒连接,完成p GEX-6P-1-APRP融合表达载体的构建。利用原核表达系统进行初步诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白表达情况。结果:PCR成功扩增出目的基因片段,目的基因片段大小为216 bp。提取表达载体质粒经酶切及测序分析证实p GEX-6P-1-APRR融合表达载体构建成功。利用终浓度为0.5 m MIPTG诱导,融合蛋白成功表达,分子量为35 k Da。结论:目前利用基因工程技术获得特定的鹿茸多肽的报道很少。本研究结果表明,利用原核表达系统可在体外对鹿茸富脯氨酸多肽基因(APRP)进行融合表达,并且融合蛋白GST-APRP以可溶形式表达,有利于进一步研究APRP。这也为研究其他鹿茸多肽单体成分提供重要参考。     

血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达

构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达重组体 ,并进行初步表达。从人胎盘组织中提取总RNA ,经反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增出arresten基因 ;采用T A克隆法 ,将arresten基因克隆入pGEM T载体中 ,经DNA测序确认后 ,构建原核表达重组体pRSET Arr,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,用IPTG诱导表达。所获得的arresten基因经测序正确 ,并表达重组蛋白 ,经SDS PAGE分析 ,相对分子量为 2 6ku。构建的原核表达重组体pRSET Arr能高效表达重组arresten蛋白。     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

To improve the effect of the gene immunization against Hantaan virus, we constructed the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) containing Hantaan Virus S gene coding region and CpG motif by cloning S gene segment with CpG motif into eukaryotic expression vector pTARGET^TM.After conformed by enzyme analysis, the recombinant expression vector pTARGET-hans(ISS) was transferred into Vero-E6 cells by electroporation and the transient expression of Hantaan virus nucleocapsid protein was detected by indirect immunofluorescence assay(IFA). In some transferred Vero-E6, the green fluorescence was showed, thus we can conclude that the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) was successfully constructed and expressed in vitro,which will lay a foundation for further animal vaccination.     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

信号肽及其在蛋白质表达中的应用

分子生物学研究已进入后基因组时代,其中心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构和功能。由于基因功能最终通过其表达产物——蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质上。另外,在菌株、培养和发酵等逐渐成熟的条件下,构建高效的表达载体以提高外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。随着研究的深入,发现信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用,使得信号肽的研究不仅具有重要的理论意义,而且也具有潜在的应用价值。就信号肽的结构和功能,信号肽的捕获方法及其在原核表达系统和真核表达系统中表达外源蛋白质的应用做一些介绍。     

ENC1的克隆,原核表达与数种细胞系表达谱分析

以人 3月胎脑总RNA为模板 ,用RT PCR的方法得到了ENC1(ectoderm neuralcortex 1)基因的cDNA ,经测序证实该cDNA的长度为 180 0bp ,包含ENC1的完整编码区 .将之克隆入pGEX 4T 1载体构建重组表达质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1表达 ,经Sepharose 4B纯化得到目的蛋白 .通过Northern印迹和RT PCR检验了该基因在数种细胞系中的表达 ,结果表明其在神经胶质母细胞瘤细胞系U2 5 1中有较高的表达 ,而在包括神经母细胞瘤细胞系SH SY5Y的其他数种细胞系中无表达 .与在正常生理状态下神经系统中两种细胞的表达情况相反 .这种分布不同的情况提示了ENC1在这两种不同来源的肿瘤的发生发展中具有不同作用