小麦EDR1基因的克隆、鉴定和表达

为了研究普通小麦(Triticum aestivum L.)中是否有EDR1途径存在,根据拟南芥EDR1基因及其同源物设计了一对兼并性引物,用来分离小麦的EDR1同源物.以用小麦叶片RNA合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增,获得了代表小麦EDR1基因(命名为TaEDR1)的627 bp长的cDNA片段(GenBank登录号:AY743662).此后,通过RACE技术成功地获得了编码959个氨基酸的全长TaEDR1基因的cDNA序列.TaEDR1的氨基酸序列与大麦EDR1(标记为HvEDR1)有92%的相同.在TaEDR1的羧基末端有一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶催化功能域.因为存在一个推测的核定位基序,这个蛋白可能在细胞核中起作用.首次提供了证明普通小麦中存在EDR1同源物的分子生物学证据.用半定量RT-PCR方法研究了接种小麦白粉病菌[Blumeria graminis(DC.)E.O.Speer f.sp.tritici Em.Marchal,Bgt]后叶片中TaEDR1基因的转录谱.结果表明,在接种白粉病菌后TaEDR1基因在叶片中的转录水平提高.组织特异性表达谱分析证明,小麦TaEDR1基因在叶片、茎、穗、根中均有表达.研究提示TaEDR1可能在小麦防卫应答反应中起作用.     

小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

小麦成熟期穗发芽是世界性的自然灾害,严重影响小麦的产量和品质.Viviparous-1(Vp-1)是促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子,与小麦穗发芽抗性有着密切的关系.本实验根据小麦Vp-1基因序列,以植物表达载体pAHC25为基础,成功构建了含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WVpRi.采用基因枪法轰击小麦品种新春9号幼胚材料1825个,共获得34株T0再生植株.利用Bar基因引物和干扰片段特异引物对再生植株进行PCR检测,获得Bar基因和干扰片段均为阳性的植株3株,转化率为0.16%.本研究为深入分析Vp-1基因功能,进而通过分子育种进行小麦穗发芽抗性的遗传改良提供了科学依据.     

黄瓜花叶病毒互补型载体可与CP转基因发生重组

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)作为表达载体的可行性,克隆了山东株(SD)CMV RNA3的全长cDNA,并测定了全序列.采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点.以绿色荧光蛋白(GFP)基因置换SD-CMV RNA3 cDNA的CP基因.将Fny株CMV RNA1,RNA2和嵌合SD-CMV RNA3的cDNA分别克隆在35 S启动子和终止子之间构建成表达载体.在烟草原生质体中验证了该表达载体可以表达GFP.然后将其接种到表达SD CP的转基因烟草上,试图构建成一个互补型载体.接种10d后,18棵植株中,有5棵的接种叶和其中1棵的系统叶上可检测到表达的GFP.然而1个月后,所有接种植株中都检测不到GFP.通过RT-PCR及序列分析,证实在互补系统中CMV载体与CP转基因发生了重组.上述结果对这种CMV互补型载体的可行性提出了质疑,同时也揭示了转CMV CP基因抗病毒植物的生物安全性中存在的新的问题.     

小麦类Mla基因的分离与特征分析

根据大麦MLa基因的保守区域设计了4对家族性引物.通过用家族性引物对小麦(Triticum aestivum L.)抗白粉病品系TAM104R在接种和未接种两种条件下的基因差异表达进行RT-PCR分析,获得了一个在接种条件下特异表达的基因片段RJ-3-3L,并用RACE方法获得了其cDNA全长,命名为TaMla1.序列比对显示:TaMlal与大麦MLa位点的基因家族成员具有高度同源性,TaMla1编码的氨基酸功能基序扫描表明其为一个CC-NBS-LRR型抗病蛋白.用一套中国春缺-四体材料将TaMla1定位到了小麦的1A染色体上,这正是大麦MLa基因位点在小麦中的同源区段所在的染色体.这些结果表明,TaMla1为一个类MLa抗白粉病基因.同时我们还获得了一个在不接种条件下特异表达的基因片段RW-2-3L,序列分析表明它与MLa基因也高度同源,推测其可能是一个小麦白粉病的敏感基因或抗性负调控因子.     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

一个小麦丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因的克隆和分析

用mRNA差异显示技术在含有抗白粉病基因Pm21的小麦(Tri ticum aestivum L.) -簇毛麦(Haynaldia villosa) 6VS /6AL易位系92R137中分离与抗白粉病相关的基因,获得一个命名为TaPK1的全长cDNA克隆.序列分析表明,它与大豆(Glycine max (L.) Merr.)蛋白激酶基因GmPK6高度同源.经推测,TaPK1 编码416个氨基酸的多肽,属丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族,并具酪氨酸激酶特性.TaPK1是从小麦中分离的新基因.     

应用RNAi干扰eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞中FGF5基因的表达

在小鼠FGF5基因干扰的研究中,针对小鼠FGF5 mRNA的第316～335 bp区域、第499～518 bp区域和第766～785 bp区域分别设计了发夹式RNA干扰片段,并将干扰片段连接到带有H1启动子的红色荧光表达载体上,将载体以脂质体法转染到eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞中,搜集转染后的细胞提取总RNA,并反转录成cDNA.用SYBR GREEN Ⅰ荧光定量PCR方法对转染了不同干扰载体的细胞cDNA进行检测,结果干扰载体对eGFP转基因小鼠成纤维细胞中的FGF5表达有较强的抑制作用.     

小麦类Mla基因的分离与特征分析

根据大麦MLa基因的保守区域设计了4对家族性引物。通过用家族性引物对小麦(Triticum aestivum L.)抗白粉病品系TAM104R在接种和未接种两种条件下的基因差异表达进行RT-PCR分析,获得了一个在接种条件下特异表达的基因片段RJ-3-3L, 并用RACE方法获得了其cDNA全长,命名为TaMla1。序列比对显示: TaMla1与大麦MLa位点的基因家族成员具有高度同源性,TaMla1编码的氨基酸功能基序扫描表明其为一个CC-NBS-LRR型抗病蛋白。用一套中国春缺-四体材料将TaMla1定位到了小麦的1A染色体上,这正是大麦MLa基因位点在小麦中的同源区段所在的染色体。这些结果表明,TaMla1为一个类MLa抗白粉病基因。同时我们还获得了一个在不接种条件下特异表达的基因片段RW-2-3L,序列分析表明它与MLa 基因也高度同源,推测其可能是一个小麦白粉病的敏感基因或抗性负调控因子。     

小鼠Iqcf5基因干扰载体的构建及筛选

本试验旨在构建4条针对Iqcf5(IQ motif containing F5)基因的sh RNA干扰载体,并进行有效干扰靶点的筛选,为以后进一步对Iqcf5基因功能的研究奠定基础。提取成年小鼠睾丸组织的RNA,进行反转录,扩增Iqcf5基因的编码区,并将其克隆到真核表达载体HP362-PBL-PBR-CAG-m Cherry-WPRE上。设计针对Iqcf5基因的sh RNA序列,应用基因重组技术插入到p GPU6/GFP/Neo载体中,将其与Iqcf5基因的真核表达载体共转染293T细胞,进行有效干扰靶点的筛选。构建了Iqcf5基因的真核表达载体和4条针对目的基因Iqcf5的sh RNA,分别是Iqcf5-107、Iqcf5-257、Iqcf5-425和Iqcf5-500和一个阴性对照质粒,经测序鉴定正确,共转染293T细胞,经过筛选Iqcf5-257和Iqcf5-500在293T细胞中对Iqcf5基因表达的干扰效果最佳。成功构建了Iqcf5基因的真核表达载体及其sh RNA干扰载体,并在工具细胞293T中进行了有效干扰靶点的筛选,这为下一步对Iqcf5基因功能的研究奠定了基础。     

一个小麦丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶基因的克隆和分析

用mRNA差异显示技术在含有抗白粉病基因Pm2 1的小麦 (TriticumaestivumL .)_簇毛麦 (Haynaldiavillosa)6VS/ 6AL易位系 92R137中分离与抗白粉病相关的基因 ,获得一个命名为TaPK1的全长cDNA克隆。序列分析表明 ,它与大豆 (Glycinemax (L .)Merr.)蛋白激酶基因GmPK6高度同源。经推测 ,TaPK1编码 416个氨基酸的多肽 ,属丝氨酸_苏氨酸蛋白激酶家族 ,并具酪氨酸激酶特性。TaPK1是从小麦中分离的新基因。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.