池蝶蚌CyPA的应激表达及对Hela细胞生长的影响

研究分析了池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)亲环蛋白A(Cyclophilin A, CyPA)诱导的应激反应和对Hela细胞生长的影响。采用嗜水气单胞杆菌诱导刺激池蝶蚌, 并利用Real-time PCR技术对其肝脏、性腺和血淋巴中CyPA基因mRNA的表达量进行分析, 应激实验表明, 在嗜水气单胞杆菌刺激后血淋巴、肝脏和性腺中的CyPA在诱导4h出现一个表达峰, 8h后开始下降, 说明池蝶蚌HsCyPA基因参与免疫防御应答反应; 利用pET-32a(+)表达载体, 根据HsCyPA基因cDNA的序列, 构建了含有完整开放阅读框(ORF)的表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达, 优化诱导条件后, 通过亲和层析获得了含量较高的上清可溶性蛋白; 采用MTT法, 将原核表达的重组CyPA蛋白稀释到相应(50、100、200、400和800 ng/mL)浓度, 刺激Hela细胞系后发现, 重组池蝶蚌CyPA蛋白能促进Hela细胞生长, 刺激浓度为100 ng/mL时, 达到最大增殖率18.5%。结果初步表明, 池蝶蚌CyPA是一个既参与免疫应激又对细胞的生长发育具有影响的功能广泛的蛋白质。       

重组人亲环素A的表达,纯化及活性测定

将RT－PCR扩增得到的亲环素A（CyPA）基因片段插入原核表达载体pET11c中,得到重组质粒pET11／CyPA,转入大肠杆菌获得高效表达。Spe－PAGE分析表明,重组CyPA表达量占菌体可溶性蛋白的40％以上。经50％硫酸铵沉淀和DEAESepharoseCL－6B柱层析可纯化重组CyPA。用糜蛋白酶偶联法测定显示重组CyPA具有肽基脯氨酸顺／反异构酶活性。     

重组人亲环素A的表达、纯化及活性测定

将RT－PCR扩增得到的亲环素A（CyPA）基因片段插入原核表达载体pET11c中,得到重组质粒pET11／CyPA,转入大肠杆菌获得高效表达。Spe－PAGE分析表明,重组CyPA表达量占菌体可溶性蛋白的40％以上。经50％硫酸铵沉淀和DEAESepharoseCL－6B柱层析可纯化重组CyPA。用糜蛋白酶偶联法测定显示重组CyPA具有肽基脯氨酸顺／反异构酶活性。     

人亲环素A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用于防治器官移植排斥反应的药物CsA发挥作用必须由体内受体蛋白亲环素(CyP)来介导。CyP是一个功能相关的蛋白家族,具有肽基脯氨酸顺/反异构酶(PPIase)活性,能催化细胞内蛋白质的折叠、装配和运输。CyP自身抗体与某些自身免疫病也有关系。亲环素A(CyPA)是免疫抑制剂CsA在体内的主要受体蛋白。本研究对CyPA基因进行了克隆和序列测定,并构建了表达载体,在大肠杆菌中获得高水平表     

小球藻亲环蛋白A的酶活性及过表达拟南芥抗盐性分析

在前期研究中分离到噬碳酸盐小球藻（Chlorella sp.X1）的亲环蛋白基因CsCyp1A（登录号：KY207381）,编码CsCyp1A蛋白是否具有肽酰脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性功能是进一步研究它参与小球藻耐盐生物学过程的基础。通过His标签的pQE-30-CsCyp1A原核蛋白表达载体,经IPTG诱导它的E.coli M15菌株表达融合蛋白,Nitra-柱纯化后获得纯化的30 kDa左右的His-CsCyp1A融合蛋白质,Western杂交检测到HisCsCyp1A蛋白的杂交信号。酶活性分析显示,HisCsCyp1A融合蛋白中生色基团的产生速度明显快于对照,表明CsCyp1A蛋白可以催化底物N-succinyl-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide中Xaa-Pro肽键的顺反折叠,说明纯化的CsCyp1A蛋白具有PPIase活性。典型的亲环蛋白家族成员具有肽酰脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性,参与折叠和转运、信号转导、免疫调节、细胞凋亡等生物学过程。真空渗入法侵染转化的拟南芥在35S启动子驱动下超表达CsCyp1A基因,耐盐性研究表明它提高了过表达株系对NaCl胁迫的耐性,揭示小球藻CsCyp1A基因的抗盐性功能,它将成为抗逆育种的基因资源。本研究也为探索小球藻亲环蛋白A的抗盐碱胁迫生物学作用和分子育种奠定了基础。     

大豆亲环蛋白基因的克隆与分析

亲环蛋白 (cyclophilin)基因广泛地存在于动植物中。在植物中 ,该基因受许多非生物 (abiotic)因子和化合物的调节。利用RT_PCR的方法克隆了一个大豆 (GlycinemaxL .)亲环蛋白基因 (GmCyp1)。该基因的氨基酸与一个菜豆亲环蛋白蛋白质序列的同源性达 91%。Southern杂交结果表明GmCyp1以一小家族存在。用来源于酵母细胞壁成分的激发子处理大豆悬浮细胞 ,发现GmCyp1的表达在所观察的时间范围内没有明显的变化 ,表明GmCyp1的表达受生物因子的影响较小     

大豆亲环蛋白基因的克隆与分析

亲环蛋白(cyclophilin)基因广泛地存在于动植物中.在植物中,该基因受许多非生物(abiotic)因子和化合物的调节.利用RT-PCR的方法克隆了一个大豆(Glycine max L.)亲环蛋白基因(GmCyp1).该基因的氨基酸与一个菜豆亲环蛋白蛋白质序列的同源性达91%.Southern杂交结果表明GmCyp1以一小家族存在.用来源于酵母细胞壁成分的激发子处理大豆悬浮细胞,发现GmCyp1的表达在所观察的时间范围内没有明显的变化,表明GmCyp1的表达受生物因子的影响较小.     

斜纹夜蛾ppie基因的克隆及表达载体构建

肽基脯氨酰基顺反异构酶E (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase E, PPIE)是亲环蛋白家族的成员之一,具有肽基脯氨酰基顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, PPIase)活性,能与亲环蛋白抑制剂CsA特异性结合。PPIE具有两个结构域:N-端的RNA识别域(RNA Recognition Motif, RRM)和C-端的PPIase活性域。PPIE和其他亲环蛋白一样,具有蛋白质折叠功能。研究表明,哺乳动物细胞中的PPIE能抑制流感病毒复制,能与MLL PHD3相互结合。但昆虫细胞中PPIE的功能研究较少。本文以斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,克隆得到ppie基因,通过生物信息学分析发现,斜纹夜蛾ppie基因ORF全长876 bp,共编码291个氨基酸,具有亲环蛋白家族标签:YQGSlFHRIIPDFMCQGG。构建了真核表达载体pIZT/V5-His-ppie,结果证明,构建的真核表达载体能在昆虫细胞中表达,融合蛋白大小为36 kDa左右,与预测大小一致。还通过免疫荧光实验确定,PPIE定位于细胞核中,与前人研究报道一致。本文研究内容将为进一步研究斜纹夜蛾PPIE功能奠定基础。     

核桃JrGRAS2基因响应热胁迫的表达及功能分析

GRAS转录因子在植物响应逆境中起重要作用。为更好的了解核桃（Juglans regia）在逆境胁迫下的适应机制,本研究从‘香玲’核桃转录组中克隆获得一条GRAS基因（命名为JrGRAS2）,对其在不同高温胁迫下的表达进行分析,并将该基因插入酵母表达载体pYES2中构建重组载体pYES2-JrGRAS2,将pYES2-JrGRAS2转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSCI,同时以转化pYES2的重组酵母作为阴性对照,在酵母表达系统中研究该基因的抗热胁迫功能。结果显示,该基因开放读码框（ORF）全长1296bp,拟推导的蛋白分子量为47405.83Da,含有氨基酸数为431,理论等电点为5.66。在热胁迫下,JrGRAS2基因被显著诱导,特别是在36℃胁迫0.5h的茎内,其表达相对于对照被上调了335.5倍。对两种酵母进行热胁迫,发现转JrGRAS2基因酵母表现出较对照更高的生存活性。表明JrGRAS2基因具有响应热胁迫的能力,且能提高酵母的抗性,JrGRAS2基因可作为核桃逆境应答的重要候选基因。     

四翅滨藜盐胁迫应答基因AcPsbQ1的克隆及其在酵母中的功能分析

光系统II亚基蛋白Q(Photosystem II subunit Q, PsbQ)是组成光系统II(PSII)复合体的重要外周蛋白之一,对维持PSII放氧活力起重要作用。在盐胁迫下,高浓度的Na⁺和Cl^-在叶绿体中积累会严重破坏叶绿体的结构,抑制光合作用,使植物生长缓慢。文章通过筛选盐生植物四翅滨藜(Atriplex canescens) cDNA文库,获得一个在PSII中与放氧关系密切的放氧复合体蛋白基因PsbQ,命名为AcPsbQ1(GenBank登录号：KJ027025)。AcPsbQ1基因开放阅读框为699 bp,编码由233个氨基酸组成的前体蛋白。为了研究该基因的功能,文章克隆了AcPsbQ1基因并转化至酵母中,高盐和干旱胁迫处理实验表明转AcPsbQ1基因酵母相比于野生型酵母对高盐和干旱有更强的耐受力。为了进一步研究AcPsbQ1是否参与植物抗逆应答反应,利用实时荧光定量PCR法测定AcPsbQ1在胁迫处理条件下的表达变化。结果表明,用0.4 mol/L NaCl处理四翅滨藜12 h后,AcPsbQ1基因的表达量明显高于未处理的对照,表明AcPsbQ1基因的表达受盐胁迫诱导,同时,干旱胁迫也会提高AcPsbQ1基因的表达水平。上述结果表明该基因可能参与盐生植物四翅滨藜的抗逆胁迫应答反应。     

烟草类锌指基因NtZFL基因的功能分析

从烟草cDNA中分离出一个类锌指基因NtZFL,开放读码框321 bp,编码106个氨基。QRT-PCR分析表明MV、H₂O₂、ABA、冷胁迫处理都提高了NtZFL在烟草的表达,Northern blot分析表明该基因在烟草的不同组织中具有组织特异性,在幼叶和花中表达量较高。亚细胞定位表明NtZFL蛋白是定位在细胞壁中的蛋白。NtZFL基因启动子驱动GUS基因转烟草植株显示在幼苗中整株有表达,但在根部和叶脉处表达量较高。     

马蔺对不同浓度NaHCO3胁迫的生理响应

为探讨不同浓度NaHCO₃胁迫下,马蔺叶片的膜透性、可溶性蛋白及膜脂过氧化物含量的变化规律,以1年生马蔺实生苗为研究对象,通过对细胞膜透性、膜质过氧化产物MDA、SOD、POD和可溶性蛋白等指标进行测定,研究在盆栽控盐条件下,马蔺对NaHCO₃胁迫的适应与响应。结果表明：随着NaHCO₃浓度和胁迫时间的增加,对马蔺叶片可溶性蛋白含量的影响总体是先下降后上升的趋势,在30 d时,0.4%和0.6%盐浓度胁迫下的马蔺的可溶性蛋白含量上升较大,分别比对照高：21.7%,38.6%;在NaHCO₃盐胁迫的10~20 d,马蔺叶片的的膜透性略有降低;在20~30 d时,膜透性迅速上升;NaHCO₃胁迫20 d时,除对照外其他盐浓度胁迫下的马蔺叶片的POD活性都达到了最大值,分别比对照高95%,103%,496%;相同盐浓度胁迫下,随着时间的延长,SOD活性变化趋势是先下降后上升;MDA作为膜脂过氧化作用的主要产物之一,随着盐浓度的增加和盐胁迫时间的延长,在30d时0.6%浓度的马蔺叶片中MDA含量大量积累。综上所述,马蔺有抗盐（NaHCO₃）胁迫的能力,是重要的盐碱地生植物,本研究为马蔺的抗盐碱性研究又提供了一有力证据,同时为今后将马蔺应用于治理盐碱土地增加了理论基础。     

过量表达水稻细胞质型OsAPXs基因提高转基因烟草的耐盐性

为了验证水稻(Oryza sativa L.)细胞质型APXs与细胞耐盐性的关系,实验分别将OsAPXa和OsAPXb（基因登录号：D45423、AB053297）转化到烟草(Nictiana tabacum,N.plum)植株中。Southern结果表明,二基因分别整合到烟草的基因组;Northern分析表明,外源基因在转基因烟草中得到高效表达;在碳酸盐逆境下,T2代转基因植株与野生型对照相比,其APX活性呈现显著的提高,T₂代品系的H₂O₂含量和叶片受害程度显著低于野生型;T₂代品系分别在含有10 mmol·L^-1 NaHCO₃、5 mmol·L^-1 Na₂CO₃的MS培养基上生长,根的生长受到抑制,叶片产生黄化;野生型烟草则难以存活。水稻细胞质型OsAPXs基因的过量表达提高了转基因烟草的耐盐性,揭示出OsAPXa和OsAPXb在碳酸盐逆境应答过程中发挥着重要的作用。     

西伯利亚蓼谷氨酰胺合成酶基因的克隆及碱性盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的谷氨酰胺合成酶基因(Glutamin synthetase,GS)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列,以下简称为PsGS基因。该序列全长1 273 bp,其5'非翻译区178 bp,3'非翻译区24 bp,开放阅读框编码356个氨基酸残基;根据与其他植物谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列的比对以及系统进化分析的结果,确定此基因为谷氨酰胺合成酶基因家族成员;经过SignalP3.0预测该蛋白没有信号肽,无切割位点,为非分泌蛋白。经过ProtParam计算该蛋白的理论等电点为5.55,分子量为39.2 kD,不稳定系数为43.82%,为非稳定蛋白。实时定量PCR分析表明,PsGS在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达。在3%NaHCO3诱导下,该基因在叶和茎中表达升高,在地下茎中表达受到抑制,推测该基因在抵御碱性盐迫时具有重要作用。     

铜胁迫条件下土壤微生物对海州香薷光合特性和叶绿素荧光参数的影响

为探讨铜（Cu）胁迫条件下土壤微生物对海州香薷（Elsholtzia splendens）光合生理和叶绿素荧光参数的影响,实验设置添加Cu（Cu胁迫）、接种土壤微生物、添加Cu与接种土壤微生物等3个处理,以不添加Cu与不接种土壤微生物为对照（CK）。结果表明：接种土壤微生物处理的植株相对叶绿素含量、净光合速率（P_n）、水分利用效率（WUE）均显著高于CK;且对初始荧光（F_o）和最大光化学效率（F_v/F_m）均有显著性影响。与CK相比,添加Cu降低了海州香薷的P_n和气孔导度（G_s）,但胞间CO₂浓度（C_i）的变化与P_n相反,表明其对光合作用的影响主要是非气孔限制因素。添加Cu的植株相对叶绿素含量显著下降,但Cu胁迫下接种土壤微生物提高了植株相对叶绿素含量,差异显著。在Cu胁迫条件下,接种土壤微生物的植株具有较高的F_v/F_m及较低的F_o,显著提高了海州香薷的WUE、P_n、G_s。说明接种土壤微生物可通过提高相对叶绿素含量、改善叶绿素荧光和光合作用来减轻Cu胁迫对海州香薷植株造成的伤害,从而提高海州香薷耐受Cu胁迫的能力。     

藜磷酸肌醇5-磷酸酶基因(CaP5P)的表达分析和胁迫响应检测

植物通过多种信号途径感知外界环境变化,从而引发一系列的信号级联反应,其中磷脂信号途径起着重要的作用。本研究从藜盐胁迫差减文库中获得了一个EST05序列,利用RT-PCR检测了其在非生物胁迫下表达趋势,显示EST05序列在非生物胁迫下的表达有升高。随后利用RACE技术获得其全长编码序列,测序结果显示其与蓖麻(Ricinus communis) 的磷酸肌醇5-磷酸酶基因(P5P)的同源性达56%,遂将其命名为CaP5P。最后过量表达CaP5P在拟南芥中初步验证了功能,转基因植株表现对盐胁迫耐受性降低的趋势,呈现负调控的特征。本研究对磷酸肌醇5-磷酸酶基因功能的初步研究为磷脂信号途径中负调控组分的分析提供了参考依据。     

生长素和氯化钙对盐胁迫下沙冬青幼苗的缓解作用

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是亚洲中部荒漠地区唯一的常绿阔叶灌木,本课题组已将其在天津引种栽培成功。为进一步了解生长素和氯化钙对沙冬青在盐胁迫下的缓解作用,用水培方法培养沙冬青幼苗,测定其在1.3%NaCl胁迫下经不同浓度的生长素和氯化钙处理后抗氧化酶活性、PSII光化学效率以及其它与植物抗性有关的生理指标的变化。结果表明,一定浓度的IBA和CaCl2处理可以促进盐胁迫下沙冬青幼苗的生长、提高叶绿素的含量、增强保护酶的活性、降低丙二醛含量,缓解了盐胁迫。但是当IBA、CaCl2浓度分别达到5和20mmol.L-1时则对沙冬青幼苗产生伤害。综合各项生理指标说明,CaCl对沙冬青盐胁迫的缓减作用要优于IBA。     

铝胁迫下北美车前和车前生长及叶绿素荧光特性的比较研究

采用系列浓度AlCl₃溶液（100、500、800、2 000 mg·L^-1）进行处理,在处理后不同时间（0,10、20、30 d）,测定北美车前（Plantago viriginica）和车前(P.asiatica)的生长及叶绿素荧光特征指数,旨在比较外来入侵种北美车前和同属本地种车前的生长及叶绿素荧光对铝胁迫响应的差异。结果表明,车前和北美车前的根冠比在轻度铝（Al³⁺=100 mg·L^-1）处理下略有上升,在中度（Al³⁺=500 mg·L^-1）以上铝浓度处理下开始显著下降;叶绿素a、b含量在轻度铝处理下变化不明显,随着铝浓度的增加和处理时间的延长呈现明显下降趋势;叶绿素荧光参数F_v/F_m、Φ_PSⅡ及F_v/F_o值在低浓度铝的短时间处理下略有上升,随着铝浓度的升高和处理时间的延长则明显下降。结果表明铝胁迫对上述两种植物的生长和叶绿素荧光参数均有一定影响,但北美车前各参数的下降幅度小于车前,表现出比车前更为耐铝的生理特性。     

青杨雌雄扦插苗光合作用日变化与叶绿素荧光参数特征

以青杨雌雄扦插苗为对象,探究其叶绿素荧光参数和光合作用日变化特征。结果表明:青杨扦插苗的Pn、Tr和Gs日变化均呈"双峰"型曲线,有明显的"午休"现象,但是不同性别Pn、Tr和Gs的高峰和低谷出现的时间和大小不同。青杨雌雄植株的WUEi从8:00开始降低到一个最小值后升高,且雌株在16:00出现1个峰值;雄株叶片的Pn、Gs、Tr、WUEi、Fm、Fo、Fm'、Fo'、Fv'/Fm'、ETR显著大于雌株(P0.05),而NPQ则是雌株显著大于(P0.05)雄株,Ci、Ls、Fv/Fm、Fv/Fo、ФPSⅡ、qP性别间差异则不显著(P0.05);相关性分析结果表明,对Pn影响最大的因子是Gs,其次是Ca、PAR、RH、Ta和VPD。对Tr影响最大的因子是Gs,其次是Ca、RH、PAR、Ta和VPD。可见,与雌株相比,青杨雄株的捕获光能效率、电子传递速率、光合效率以及水分利用效率较高,雄株对逆境适应能力更强。     

外源NO对增补UV-B辐射下兴安落叶松幼苗叶片光合色素和叶绿素荧光特性的影响

在增强UV-B辐射下,以3年生兴安落叶松幼苗为实验材料,研究了外源NO供体硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP)对幼苗的光合色素（Chla、Chlb和Car）和叶绿素荧光参数的影响。方差分析结果表明0.5 mmol·L^-1的SNP对增补UV B胁迫下的兴安落叶松幼苗产生显著影响。0.5 mmol·L^-1的SNP能够显著抑制增补UV-B辐射后光合色素、F_v/F_m、Φ_PSⅡ、F_v′/F_m′和qP的明显下降以及Chla /Chlb、F_o和NPQ的升高。表明了外源NO能够减轻UV-B辐射胁迫下兴安落叶松幼苗光合反应中心的生理损伤,从而增强兴安落叶松幼苗对增补UV-B辐射胁迫环境的适应能力。