非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、热性、高度接触性动物传染病,其病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群病死率高达100%。为了建立一种基于合成肽技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体血清学检测方法。本研究根据ASFV p30、p54和p72三种重要抗原设计3条合成肽,以此为包被抗原建立了ASFV间接ELISA抗体检测方法,并验证其敏感性、特异性、稳定性以及与进口试剂盒的符合率。结果显示,建立的间接ELISA方法的敏感性为91.4%,特异性为98.1%,批内和批间变异系数分别为3.7%～10.1%和4.7%～14.9%。与进口试剂盒比较,符合率为92.9%。结果表明该方法检测结果准确性高、且稳定性好,可检测ASFV特异性抗体。     

乙型脑炎病毒（JEV）ELISA检测方法的建立

目的建立猪乙型脑炎病毒（JEV）抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。     

新型冠状病毒S蛋白抗体制备及双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

由SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)引起的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)自2019年底暴发以来,已导致上亿人次感染和数百万人死亡,严重威胁着全人类的生命健康。为了建立一种能快速对新冠病毒疫苗中S蛋白抗原进行定量检测的方法,本研究通过免疫山羊制备多克隆抗体作为包被抗体,通过杂交瘤细胞技术制备了S蛋白特异性单克隆抗体并作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法,并验证其线性范围、敏感性、特异性、稳定性及符合率。结果显示,建立的双抗体夹心ELISA检测方法线性范围为1U~64U,相关系数R²大于0.99;特异性良好,敏感性为92.1%;批内和批间变异系数分别为2.5%~11.7%和1.3%~14.8%,检测已知背景样本符合率为96.7%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高、且稳定性和准确性高,可用于新冠疫苗中S蛋白抗原含量测定。     

管式磁微粒非洲猪瘟病毒pp62蛋白化学发光抗体检测方法的建立

【背景】非洲猪瘟(African swine fever, ASF)作为高致病性传染病,给我国生猪养殖业造成了严重的经济损失,因此建立快捷、灵敏的诊断方法至关重要。【目的】建立一种管式非洲猪瘟病毒pp62蛋白化学发光抗体检测方法。【方法】以重组pp62蛋白作为包被抗原,羧基磁珠(carboxylic magnetic beads)作为固相载体,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)标记的兔抗猪IgG作为酶标二抗,通过对反应条件进行优化,采用非洲猪瘟国家参考品作为溯源血清绘制出标准曲线,建立基于ASFV pp62蛋白的化学发光抗体检测方法。【结果】用建立的化学发光方法检测277份临床样品血清,通过受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析确定阴性、阳性临界值,并确定判定标准：浓度值>140.02 U时为抗体阳性,浓度值<140.02 U时为抗体阴性。此方法对6种不同的病原血清抗体进行检测均无交叉反应,且批内和批间变异系数均在10%以内,与商品化非洲猪瘟抗体检测试剂盒的符合率达96.7%。【结论】本研究建立的管式非洲猪瘟病毒化学发光抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可为非洲猪瘟早期监测及试剂盒研发提供参考。     

猪瘟病毒抗体纳米荧光检测试纸条方法建立及性能评价

基于镧系元素Eu微球标记技术建立了一种猪瘟病毒抗体检测的免疫层析方法。通过对反应体系中包被浓度、复溶浓度以及反应时间等因素进行优化,确定最适的反应条件,建立检测方法,然后通过从敏感性、特异性、重复性、临床评价等方面对其进行性能评价。对反应体系进行优化,最终确定包被浓度为0.1 mg/mL,复溶浓度为6倍稀释,检测时间为15 min。通过对试纸条的性能评价可以得出,猪瘟病毒抗体荧光检测试纸条的敏感性为猪瘟阳性血清国家参考品倍比稀释至1∶128倍仍可以检测到;对常见的猪繁殖与呼吸综合征、猪I型疱疹病毒、猪口蹄疫、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等抗体阳性血清无交叉反应;批内和批内变异系数均小于10%;经临床评价,与商品化的猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒相比阳性符合率为90%,阴性符合率为100%,总符合率为97.7%;与荧光抗体中和试验(FVNT)的阴性符合率为100%,阳性符合率为93%,总符合率为98.5%。综合评定认为本研究建立的猪瘟病毒抗体纳米荧光检测方法,符合各项性能参数,可以快速、经济、方便地对猪个体及群体进行猪瘟病毒抗体检测评估,可广泛应用于猪场管理中。     

流行性出血热冻干致敏人O型血球的研制及其应用

本文应用致敏的人O型血球研究反向间接血凝(RPHA)和反向间接血凝抑制(RPHI)方法用以检测流行性出血热抗原抗体,并试验成功用pH9.0硼酸盐水制备灭活鼠脑病毒液作为抗原。为抗原制备提供了一种简便的方法。以上RPHA法用于检测组织培养内病毒与用荧光法检测细胞内病毒抗原法结果一致,用RPHI检测病人血清抗体效价,特异性高,敏感性与IFA相同。该致敏血球和抗原是冻干制品,稳定性好、使用方便,是一种代替荧光检测病毒抗原和抗体的良好制品。     

犬瘟热病毒（CDV）ELISA检测方法的建立与应用

目的建立犬CDV抗体ELISA检测方法。方法培养vero细胞,接种CDV病毒,制备vero正常抗原和CDV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为1∶32 000、10μg/mL和1∶8 000;正常、特异抗原批内变异系数分别为9.1%和5.8%,批间平均变异系数分别为8.8%和6.6%;检测灵敏度为1∶2 560;与犬细小病毒（CPV）、犬肝炎病毒（ICHV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于犬CDV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒核酸的2段保守序列(VP72和K205基因)设计合成了3对引物和探针,摸索其反应条件,优化方法,比较方法的线性、特异性、灵敏性和重复性。结果发现,这3对引物和探针的非洲猪瘟病毒方法检出限均小于6拷贝数/反应,在10～106拷贝数/反应之间均呈良好的线性关系,定量范围内的检测变异系数均低于15%,且不与猪常见的2种病毒发生交叉反应,适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测,有利于在源头、食品加工、食品销售等各个环节加强对生鲜猪肉及各类猪肉制品中非洲猪瘟病毒的检测,切实降低潜在风险。     

小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

本研究旨在建立小反刍兽疫病毒H蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法。以H蛋白4个反应原性较好的B细胞表位串联后为检测抗原,在确定抗原包被量和血清稀释度,优化血清和酶标二抗反应时间的基础上,用ROC曲线分析确定检测临界值,建立了小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法,然后对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价。结果显示,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析检测方法最佳抗原包被浓度为1.5×10^-6μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶100;血清及酶标二抗孵育时间均为10 min,检测方法的临界值为S/P=9.77%,批内及批间变异系数均小于10%;与口蹄疫、羊痘、蓝舌病及山羊传染性胸膜肺炎阳性血清不发生交叉反应;用建立的化学发光法和市售小反刍兽疫抗体cELISA试剂盒平行检测247份田间血清,两者相对符合率为94.33%,但化学发光法敏感性更高。研究结果表明,建立的小反刍兽疫病毒H蛋白抗体化学发光免疫分析方法灵敏、特异、稳定,可用于田间血清样品小反刍兽疫抗体检测。     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RPA）检测方法的建立及其应用

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）在我国出现了多种基因亚型毒株混合流行和重组的复杂变化，其引起的猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveand Respiratory Syndrome,PRRS）已成为危害程度仅次于非洲猪瘟的重要疫病。为建立一种快速而敏感性高的美洲型PRRSV检测方法，本研究分析了国内美洲型全基因组序列，利用重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA），设计合成特异性引物和探针，优化反应体系和条件，建立美洲型PRRSV实时荧光RPA检测方法，通过特异性、敏感性、重复性试验及田间样品的比对检测，评价该方法的检测能力，并测定和分析了田间阳性样品的ORF5基因序列。结果显示，该方法在42℃、20 min内即可完成检测，最低检测美洲型PRRSV载量为50拷贝/μL，且与欧洲型PRRSV、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应，特...     

标记抗体技术与病毒快速诊断

病毒性感染的快速诊断技术通常检测体液标本中的微量病毒抗原和早期IgM抗体,在病毒感染后几天内就可作出诊断。检测微量病毒抗原和早期IgM抗体,要求检测技术敏感性高,特异性强,重复性好,方法简便。近几年来发展起来的标记抗体技术能够满足上述要求。 荧光素、酶或核素能与抗体结合成标记抗体,标记抗体仍然具有与特异性抗原结合的免疫学特性,形成一种标记的免疫复合物。这种标记的免疫复合物可以用仪器来检测。 标记抗体技术包括免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫分析。 一、免疫荧光技术 将荧光素与特异性抗体共价结合,成为荧光抗体。荧光抗体再与标本中抗原形成抗原抗体复合物,借助荧光显微镜观察标本中所显示的荧光。免疫荧光技术用于检测细胞内微量病毒抗原,对不产生细胞病变的病毒更具有诊断价值。也可用于病毒抗原的定位和检测体液中的特异性抗体。在几小时内可获得实验结果,已广泛用于病毒实验室快速诊断。 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素和罗丹明,异硫氰酸荧光素的荧光呈黄绿色;罗丹明的荧光显红色。     

Immuno-PCR法诊断早期梅毒的方法学建立及其应用

目的建立Immuno-PCR法诊断早期梅毒的方法学,评价其灵敏度、特异性、重复性及其临床应用。方法利用基因重组TpN47抗原免疫新西兰兔,制备抗体并用Weston blotting检测;利用抗TpN47抗体作为捕获抗体与血清中TpN47抗原结合,通过链霉亲和素、生物素化抗体、生物素化DNA和PCR扩增等建立Immuno-PCR法检测梅毒螺旋体抗原TpN47体系;评价该方法的灵敏度、特异性和重复性;收集200例临床标本通过Immuno-PCR法、ELISA、TPPA和TURST法进行临床应用比较。结果 Weston blotting结果显示TpN47抗体阳性;Immuno-PCR比ELISA法敏感性强103倍,比TPPA、TURST强105倍;特异性高,重复性好。临床标本中Immuno-PCR法敏感性和特异性分别为86.00%（P〈0.05）和100.00%,ELISA法为71.00%和98.00%,TPPA法为65.00%和100.00%,TRUST法为68.00%和95.00%。结论 Immuno-PCR法检测梅毒螺旋体TpN47抗原敏感性高,特异性强,重复性好,可作为梅毒螺旋体感染的早期诊断方法 。     

猪O型口蹄疫病毒抗体化学发光酶联免疫检测方法的建立

表达并纯化猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1重组蛋白作为检测抗原,建立了一种快速检测猪O型口蹄疫病毒抗体的化学发光酶联免疫(CLEIA)检测方法。建立的VP1-CLEIA方法特异性为100%,板内变异系数在1.10%–6.70%之间,板间变异系数在0.66%–4.80%之间,具有较好的特异性和重复性,且灵敏度高于ELISA方法。通过对山东、辽宁、河北地区采集的250份临床血清的检测表明,该方法与间接ELISA试剂盒的符合率为93.50%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率为94.00%,表明本次建立的VP1-CLEIA检测方法可以用于猪O型FMDV感染或疫苗免疫后抗体水平检测。     

EB病毒DNA聚合酶基因的表达与纯化及其在鼻咽癌病人诊断中的应用

以Epstein-Barr病毒(EBV)DNA聚合酶为抗原,建立了简便、快速、敏感和特异的鼻咽癌诊断方法.构建原核表达载体pRSET-DNA聚合酶及其亚克隆pRSET-A1和pRSET-A2,在BL21(DE3)中表达的产物,经Western-blot检测其抗原性并用于检测鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)病人血清中的抗体.在NPC病人血清中存在抗EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体,并证明DNA聚合酶的抗原性主要集中于后2/3片段(A2)上.Western-bolt检测A2/IgG抗体的敏感性和特异性分别为80%和100%.对46份NPC病人血清和46份非NPC头颈癌症病人血清,用ELISA检测A2/IgA,敏感度为89%,特异度为93%.初步建立了ELISA检测NPC病人血清中A2/IgG抗体的方法,获得较高的敏感性和特异性.     

群特异性蓝舌病病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备群特异性抗蓝舌病病毒（BTV）单克隆抗体,并对其特性进行鉴定,为建立检测BTV抗原及抗体的ELISA方法奠定基础。方法：用纯化的BTV颗粒为免疫抗原免疫BALB/c鼠,以大肠杆菌表达的VP7蛋白作为筛选抗原,用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株;选取抗体效价最高的一株制备BTV单克隆抗体,以该抗体为捕获抗体与8种不同血清型BTV进行ELISA反应,结果与细胞病变反应进行比对;以该抗体为竞争抗体,与12种不同血清型绵羊BTV抗血清进行竞争ELISA反应,并将结果与参比c-ELISA试剂盒结果进行比对。结果：筛选出5株稳定分泌BTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并选其中一株（3E2）制备了高纯度的单克隆抗体;该单抗用于检测不同血清型BTV,与细胞病变反应结果完全相符;用于检测不同血清型绵羊BTV抗血清,其结果与参比c-ELISA试剂盒符合率为100%,与鹿流行性出血热病毒抗原和抗体均无交叉反应。结论：制备的BTV单克隆抗体具有良好的群特异性,可用于检测不同血清型BTV抗原及BTV抗体。     

结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片的制备及应用

目的:用重组结核分枝杆菌ESAT6、CFP10、M16和M38抗原制备相应的抗体检测蛋白芯片。方法:将制备的结核分枝杆菌抗原ESAT6、CFP10、M16和M38及购买的LAM抗原点于醛基化修饰的玻片上,制备成结核抗体检测蛋白芯片;使用该芯片对130例临床结核病患者和50例健康体检者血液样品进行检测,分析其敏感性和特异性,以及5项结核抗体的构成比。结果:结核杆菌抗体检测蛋白芯片的敏感性为90.8%(118/130),特异性为90%(45/50),LAM的检出率最高为91.5%。结论:用ESAT6、CFP10、M16和M38及LAM抗原制备的结核杆菌抗体检测蛋白芯片用于结核病辅助诊断的敏感性和特异性较高,可用于结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片试剂盒的开发。     

一种新的无传染性的检测HBeAg抗HBe的单克隆酶联免疫吸附法(MonoLISA)的建立与应用

应用我室自1988年5月以来建立的抗乙型肝炎e抗原两个抗原决定簇的单克隆抗体,和在大肠杆菌中高效表达的乙型肝炎病毒e抗原,组装成检测HBeAg/抗HBe的酶联免疫试剂(简称Mo-noLISA)。测定了该试剂的特异性、敏感性和可重复性,并与用日本单克隆抗体和血清e抗原组装的类似的EIA试剂进行了比较。结果两种试剂检测92份乙肝病人血清e抗原和38份血清e抗体的总符合率,分别为97.8％和100％。用两种试剂同时滴定一份已知HBeAg阳往和一份抗-HBe阳性的血清,证明两者的敏感性无显著差异。重复性试验证实,该试剂的重复率为100％。由此证明,用抗-HBeMcAb和基因工程抗原组装的诊断试剂,特异性强,敏感性高,可重复性好,且无传染性。这不仅为诊断试剂原材料的更新提供了丰富的来源,而且将该类试剂提高到一个新水平。     

猴免疫缺陷病毒抗体免疫梳检测方法的建立及应用

目的以基因工程技术制备猴免疫缺陷病毒(SIV)的SIV30蛋白作为抗原诊断试剂,建立免疫梳方法(IC)用于特异性检测实验猴血清中抗SIV的抗体Ig G。方法应用原核表达载体p GEX-4T-1构建SIV SIV30基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为诊断抗原,建立免疫梳标准化检测程序,并应用于临床检测。结果最佳抗原包被量为0.02 mg/m L;制备好的IC均能够特异性检测到相应的SIV阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,SIV30蛋白能够敏感地检测到1∶400倍稀释的SIV阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对10份可疑猴血清样品进行检测,IC与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。结论原核表达了SIV30蛋白,制备了IC,并应用于临床检测。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.