PCR-双酶切鉴定STGC3抑癌基因重组子假阳性研究

目的:探讨PCR与双酶切技术联合使用鉴定阳性重组子的特异性和可靠性,评价长期保存的重组质粒再次测序的必要性。方法:对随机选取已经过测序验证的三组STGC3/pcDNA 3．1( )、一组STGC3/pGEM Easy T Vector重组子首先经过LB氨苄平皿培养挑单克隆筛选,然后单独或联合使用PCR和双限制性内切酶BamH I和Xho I酶切方法鉴定,将阳性样品送交生物工程公司测序,比较并评价两者结果的一致性。结果:三组STGC3/pcDNA 3．1( )重组子经PCR—双酶切检测阳性而不能通过测序,说明该检测方法在运用中确实存在假阳性,同时证明重组载体在长期保存后有必要再次鉴定。结论:保存过程中的杂菌污染、实验室操作中的质粒交叉污染以及重组载体基因突变是基因工程操作中不可忽视的问题;PCR—双酶切鉴定重组载体存在假阳性的问题,实验设计中应包含阳性与阴性(污染)对照,并有足够的重复实验。     

第10届国际生物奥林匹克竞赛(1999)实验试题(一)

第 1实验室 :微生物学实验试题说明　　在实验考试部分中要检验你所了解的生物学基本方法、程序和技术 ,并展示你能利用这些知识达到实验目的。这将在以下 4个不同的实验中进行检验。第 1实验室 :微生物学第 2实验室 :遗传学和组织学第 3实验室 :形态学和生理学第 4实验室 :行为学每个实验考试 70 min,每个实验的分数是 2 6～ 50分 ,实验总分 1 50分。如果你在答题中选择了错误的答案和正确的答案 ,则你该题的得分将比你仅选了正确答案的得分要低。在这个实验室中有两组不同的作业 ,首先 ,你要检查你面前两个广口瓶 (广口瓶 1和 2 )的内含物…     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

稳定表达HCV 1a NS5A和NS5A-△ISDR细胞株的构建

以pBRTM／HCV-3011模板,通过PCR法扩增ns5α、LISDR(左端序列)和RISDR(右端序列),分别经XhoⅠ／EcoRⅠ、XhoⅠ／HindⅢ和EcoRⅠ／HindⅢ双酶切,连入穿梭质粒pEGFP—N3中,构建重组质粒pEGFP—N3-ns5a和pEGFP—N3-ns5a—△ISDR。对重组质粒进行酶切分析和序列测定。将这2种重组质粒通过电穿孔法转染HeLa细胞,然后在G418选择压力下进行有限稀释法筛选,用RT-PCR和荧光显微镜鉴定。经酶切鉴定和基因测序证实,重组穿梭质粒已插入目的片段ns5a、LISDR和RISDR。RT-PCR和荧光显微镜检测到目的基因的表达。以上结果说明成功构建了真核表达载体pEGFP—N3-ns5a和pEGFP—N3-ns5α—△ISDR,目的基因在HeLa细胞中得到表达,为研究HCV NS5A中是否存在抗干扰素治疗的功能蛋白提供了实验材料。     

兔防御素(MCP-1)cDNA的克隆与序列分析

从兔脾脏细胞中分离提取总RNA,经反转录PCP(RT-PCR)扩增出兔巨嗜细胞阳离子多肽(MCP-1)cDNA,插入经EcoRI和XbaI双酶切的pUC19中,构建了克隆质粒pUCDEF.进行了限制性酶切鉴定和序列分析,结果在扩增出的cDNA288个碱基中,在前片段中有一个碱基与发表的兔MCP-1cDNA序列不同,即第157位碱基由G变为A,导致编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸.该cDNA全长288bp,编码94个氨基酸,由编码信号肽,前片段及成熟肽片段的序列组成.     

碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中DNA的探讨

采用碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中的DNA,达到分离纯化目的,回收后的DNA可用于重组、PCR等研究。首先将含有目的DNA的琼脂糖凝胶用Nal溶液融解,然后加入cacl2,和NaHCO3,生成CaCO3,沉淀,DNA与cac03形成复合物,通过离心分离出沉淀复合物,利用稀酸溶解沉淀,再用无水乙醇沉降,即可回收目标DNA。利用该方法回收了质粒、毛白杨和转基因羊基因组DNA,同收率为20％～50％,0D260／OD280,为1．7～19,最大回收了21kb片段,最小回收250bp片段,回收后的DNA样品进行了PCR扩增和限制性内切酶反应,PCR可以扩增出目的片段,同时限制性内切酶可以将回收后的DNA切开,表明DNA质量良好。利用碳酸钙沉淀法可以回收琼脂糖凝胶中的DNA,此法简单、易行,较为有效。     

五个链霉菌线型质粒端粒的克隆和分析

本室从西藏采集的土壤样品中分离到了一批链霉菌,利用脉冲电泳确定了其中5株链霉菌含有较小的线型质粒。【目的】克隆、测序和分析5个线型质粒的端粒。【方法】采用改良的"在凝胶中进行DNA碱处理和限制性内切酶酶切"的方法来克隆线型质粒的端粒DNA。【结果】克隆和测序了5个线型质粒的端粒DNA。通过与链霉菌典型端粒进行比较,发现这5个新的线型质粒的端粒序列同样含有多个回文序列。但是有的端粒保守的回文序列I不一定能够"折返"与内部序列配对形成"超级发卡"结构,回文序列的"突出环"不一定都为3nt。【结论】采用改良的方法克隆和鉴定了5个线型质粒新的端粒序列,这些新端粒的特征暗示:回文序列I的"折返"和3nt的回文序列的"突出环"不是端粒复制必需的。     

第11届国际生物奥林匹克竞赛(2000)实验试题(Ⅲ)

(续 2 0 0 1年第 3期第 43页 )实验三　生物化学试题 :DNA和染色剂样品的琼脂糖凝胶电泳注意 :3个学生使用 1个电泳电源 ,在加样以后除去电泳槽下的黑纸 (图 1)。图 1　　引言 :电泳是用于分子生物学和医学的 1种分析方法。分子的净电荷在所应用的电场中影响它的迁移速度 ,电泳技术就基于这种原理。琼脂糖凝胶电泳用于提供如下信息 :·用于分离 DNA和 RNA的鉴定·用于检验 DNA的纯度·用于检验核酸的构型·用于鉴定 DNA的大小纯的琼脂糖是粉状的 ,在室温下是不溶于水的 ,为了溶解它 ,给 1个沸水浴。当开始冷的时候 ,它是 1个多聚体的…     

C型产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了0．72kb的β2毒素基因,将纯化的PER产物与载体pGEM—T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／Bam HI和Bam HI／Eco RI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPB2中含有陡毒素基因。随后用Nco I／Bam HI酶切质粒pXCPB2,回收β2毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXB2,经Nco I／Bam HI和Nco I／Hind Ⅲ／Bam HI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有陡毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21（DE3）（pETXB2）表达产物经ELISA检测和SDS—PAGE分析,重组菌株表达的β2毒素蛋白能够被如毒素抗体识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的13．26％。     

番茄1-氨基环丙烷羧酸(ACC)合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合DNA序列的构建

根据番茄ACC合成酶基因（LE—ACC2）DNA序列,以番茄(LycopersiconesculentumMill)果实的总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到预期大小的该基因编码区内部分DNA序列,插入到质粒载体pGEM—3zf(＋)的BamHⅠ和HindⅢ位点之间后转化E．coliDH—5α,可选出重组子pRE,经酶切,PCR及DNA序列分析证明克隆成功;将pRE上的目的DNA序列以反义方式构建到我室已合成并克隆的含核酶DNA序列的重组质粒pRⅠ的BamHⅠ和HindⅢ之间,构成含有反义RNA-核酶嵌合DNA序列的重组质粒pREⅠ,经酶切及序列分析,结果与预期一致.     

介绍一种简便快速的电洗脱方法

凝胶电泳是研究核酸、蛋白质等生物大分子的一项重要技术,也是 DNA 的限制性内切酶切割片断的分析、分离、纯化的一种不可缺少的方法。这样,就时常需要将某些大分子或片段从凝胶中分离纯化出来,所采用的方法很多,如渗滤法、连续电泳洗脱法、透析法等等。但是,所有这些方法都或多或少地受到诸如分子大小、回收率、纯化时间等方面的限制。联邦德国 Schleicher and Schuell 公司最近推出了新型的电洗脱仪,用于从凝胶中分离生物大分子,并可对样品进行浓缩。经我们实验室使用,效果很好。现特作介绍,供国内同     

甘蔗黄叶病毒P0蛋白基因细菌双杂交诱饵载体的构建和自激活鉴定

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank No.HQ342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。     

植物新陈代谢(2)

(续 2 0 0 3年第 38卷第 7期第 4 5页 )3　能力训练3.1　实验设计 ,不仅有助于学生掌握基本概念和原理 ,更有助于学生掌握科学的研究方法 ,培养学生的创造性思维 ,培养学生应用所学知识综合解决问题的能力 ,是培养学生综合素质的有效手段。例题 1:设计一个实验 ,验证缺硼会影响油菜的结实率。 (答案 :略 )例题 2 :设计一个实验测定洋葱表皮细胞细胞液的质量分数 ?(利用质壁分离实验原理可测定细胞的质量分数 ,答案 :略 )3.2　研究影响酶作用因素实验方法　　研究某一因素对酶促反应速度的影响时 ,应在保持其他因素不变的情况下 ,单独改变研…     

NtDREB2-PDI融合蛋白的纯化及与DRE元件结合能力的检测

将从普通烟草（Nicotiana tobaccum）‘K326’中克隆得到的转录因子基因NtDREB2,采用PCR去除NtDREB2基因的终止密码子,酶切后构建入PDI/pET28a融合表达载体。取测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表达后,用Ni-NTA纯化融合蛋白,获得了高效表达的可溶性目的蛋白。凝胶滞留（EMSA,electrophoresis mobility shift assay）实验表明融合蛋白具有结合DRE（dehydration—responsive element）元件的能力。     

杨梅铜锌超氧化物歧化酶基因(MrCu/Zn-SOD1)的原核表达及活性鉴定

为获得高表达杨梅(Morella rubra)铜锌超氧化物歧化酶(MrCu/Zn-SOD1)的工程菌,本实验采用RT-PCR技术从杨梅果实中分离扩增了MrCu/Zn-SOD1的cDNA序列(456bp),将该基因重组到原核表达载体pGEX-2T中,酶切、测序分析表明,重组质粒pGEX-MrCu/Zn-SOD1结构正确。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。IPTG诱导表达分子量约41kD融合蛋白GST-MrCu/Zn-SOD1。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽亲和层析纯化,得到高纯度的GST-MrCu/Zn-SOD1。采用氯化硝基四氮唑蓝法和黄嘌呤氧化法分析其活性。结果表明,GST-MrCu/Zn-SOD1具有特异性SOD酶活性。     

黑曲霉产木聚糖酶的分离纯化与鉴定研究

木聚糖酶的分离纯化是对其进行酶学研究和分子改良研究的基础。利用实验室选育的黑曲霉菌株Aspergillus niger SM24/a进行木聚糖酶发酵,粗酶液经过(NH_4)_2SO_4分级沉淀Bio-Gel P6除盐、UNO sphere Q阴离子交换和Enrich SEC70凝胶色谱层析四个步骤的分离纯化,成功获得了3种木聚糖酶蛋白定义为X-Ⅰ、X-Ⅱ和X-Ⅲ。随着纯化步骤的增加,各组分酶比活力得到显著提高,其数值分别为37.41、34.56和53.96 U/mg,纯化倍数分别为3.96、3.66和5.72。经质谱分析和蛋白氨基酸序列比对,初步认定X-Ⅰ属于糖基水解酶第十家族内切-β-1,4-木聚糖酶,X-Ⅱ和X-Ⅲ均属于糖基水解酶第十一家族木聚糖酶。     

拉斯克基础医学奖简介(2)

(续 2 0 0 3年第 38卷第 9期第 6 2页 )获奖时间 获奖者获奖者供职机构 (国籍 )获奖工作 (获奖原因 )备注1980伯格 ( Paul Berg)斯坦福大学 (美国 )在重组 DNA中的关键的、历史性成就 1980诺化伯耶 ( Herbert W.Boyer)加州大学 (美国 ) 重组 DNA方法学的卓越贡献 ,特别是在酶学、质粒和合成 DNA的应用科恩 ( Stanley N.Cohen)美国斯坦福大学医学院 (美国 ) 重组 DNA方法学的重大贡献 ,第一次实现了细胞间的基因转移1981麦克林托克 ( Barbara Mc-Clintock)美国华盛顿大学卡内基学院、冷泉港实验室 (美国 )第一次发现特定的遗传元件…     

2001年全国普通高等学校招生统一考试 (上海)生物学试卷(1)

本试卷分为第 卷 (第 1～ 4页 )和第 卷 (5～ 9页 )两部分。全卷共 9页。满分 15 0分。考试时间为12 0 min。第 卷 (共 60分 )一 .选择题 (共 6 0分。单选题 4 0分 ,双选题 2 0分 )(一 )单选题 (共 2 0小题 ,每小题 2分。每小题只有1个正确选项。)1.人患坏血病 ,原因是食物中缺乏 (　 )………………A.维生素 A　　 B.维生素 BC.维生素 C　　 D.维生素 D2 .合成下列物质需要供给氮源的是 (　 )……………A.糖原　　 B.脂肪　　 C.淀粉　　 D.核酸3.下列杂交组合属于测交的是 (　 )…………………A.Ee Ff Gg×Ee Ff Gg　　B.Ee Ff…     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。免疫实验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。