大肠杆菌-链霉菌穿梭载体的构建及应用

pIJ6021和pIJ4123是链霉菌的高拷贝表达载体,它们携带有受硫链丝菌素诱导的强启动子P_tipA。分别在它们的合适位点插入大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用的抗性标记基因(bla),得到了两个能在大肠杆菌和链霉菌中穿梭复制、并保持结构稳定的链霉菌表达载体：pHZ1271和pHZ1272。将透明颤菌(Vitreoscillia sp.)血红蛋白基因(vhb)克隆到pHZ1272中,用它转化变铅青链霉菌(Streptomyces lividans),经Western blotting分析和CO结合实验表明,在变铅青链霉菌中表达出了有生物活性的透明颤菌血红蛋白,从而证明所构建的pHZ1272载体具有在链霉菌中表达外源基因的功能。     

放线菌噬菌体φHAU_3中噬菌斑形成必需功能区的克隆和定位

放线菌噬菌体φHAU3是以吸水链霉菌应城变种10-22为指示菌,筛选获得的一个广谱性噬菌体,其基因组大小约为53kb,具有粘性末端。已成功地将44.7kb的φHAU3 DNA克隆到pIJ255上,构建成噬粒(Phasmid)pIJ8300;46.8kb的φHAU3 DNA克隆到pIJ285上,构建成pIJ8301。采用部分酶解和Southern杂交的方法,制作了pIJ8300和pIJ8301被Asp718和Bgl Ⅱ酶切的限制酶图谱,又综合单,双和多酶切分析的结果,定位了单一的Pvu Ⅱ和NcoI切点。综合噬粒pIJ8300和pIJ8301的特性,已将φHAU3中噬菌体功能的必需区定位在41kb的范围内。这些结果为以φHAU3为母体发展新的放线菌噬菌体奠定了良好的基础。     

麦迪霉素产生菌具有启动功能的DNA片段的克隆和分析

利用启动子探针质粒载体pIJ486从麦迪霉素产生菌总DNA中克隆得到了一段具有启动功能的DNA片段.通过限制性酶酶切分析,测定插入DNA片段大小为2.3kb.又利用载体pIJ486和pIJ487的新霉素抗性结构基因上游有多酶切点方向相反的性质,分析了插入片段在两个不同方向上的启动能力.结果表明,在两个方向上均有启动功能,但强弱相差六倍.其中在XbaI-HindIII方向上具有较强的启动能力,在变铅青链霉菌中新霉素抗性水平可达20mg/ml以上.进一步对插入片段的三个BamHI小片段进行分析的结果表明,较强启动子区域集中在BamHI-BamHI 0.79kb DNA片段上.     

类产碱假单胞菌耐热碱性脂肪酶基因的克隆

将类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligene)总DNA经Sau3AI部分酶解后的35～50kbDNA片段与经BamHI线性化及CIAP处理过的粘粒pIJ285连接,以大肠杆菌LE392为受体,构建类产碱假单胞菌的基因文库。通过三丁酸甘油酯平板和橄榄油平板法检测克隆子,获得一株具有耐热碱性脂肪酶活性的菌株LE392(pHZ1401)。随后将pHZ1401上的外源DNA片段进行亚克隆,从而获得了具有脂肪酶活性的菌株HB101(pHZ1402)和HB101(pHZ1403),它们分别携带有2.9kb和3.0kb的外源片段。两外源片段约有2kb的重叠区。HB101(pHZ1403)所分泌的脂肪酶活性比HB101(pHZ1402)高4倍,是出发菌的5倍。     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

链霉菌基因克隆载体及基因文库的构建

利用麦迪霉素产生菌中分离的质粒pSMY1(10．8kb),将pIJ30的硫链丝菌素抗性基因(tsr)克隆到psMY1上,获得了具有硫链丝菌素抗性选择标记质粒pSJ10。通过DNA体外缺失,片段播入、λ-COS片段的插入及与大肠杆菌质粒的重组等基因技术,获得了一系列psMY1衍生质粒,包括双标记质粒pSM3,大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒pBMJ2和穿梭粘粒pNMJ1。通过对这些质粒的分析,确定了质粒psMY1的复制必需区为3．06kd的EcoRI—sphI片段。质粒pSJ10、pSM3、pNMJ1具有可选择标记,多个单一确切的可克降位点,有一定范围的宿主并能在链霉菌中稳定存在等特点,故可作为链霉菌基因克隆的载体。其中pNMJl(11．15kb)是大肠杆菌／链霉菌穿梭粘粒,能有效地运载28—38kb的外源DNA片段,并能在体外包装λ噬菌体外壳,转导大肠杆菌。利用载体pNMJl,通过λ-噬菌体蛋白体外包装,在大肠杆菌中建立了螺旋霉素产生菌的基因文库,其基因覆盖率可达90％。重组DNA分子可通过转化转移到链霉菌中。     

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌lat基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1.8kb的lat基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat,经EcoRI-HindⅢ双酶切后得到lat基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌lat基因的序列及质粒pIJ77(3 pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒)中阿泊拉抗性基因(aac(3)iv)的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的lat基因两端的互补序列,以质粒pIJ773为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有lat基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的lat基因同源序列与pGH112-lat中的野生型lat基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入lat基因中,得到lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌lat基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。     

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌励基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1．8kb的地基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat．经EcoRI—HindⅢ双酶切后得到妇基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E．coli BW25113／pIJ790中得到E．coli BW25113／pIJ790／pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌纽基因的序列及质粒pIJ773（pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒）中阿泊拉抗性基因（aac（3）iv）的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的纽基因两端的互补序列,以质粒pip73为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有纽基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E-coli BW25113／pIJ790／pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的纽基因同源序列与pGH112-lat中的野生型勉基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入地基因中,得到纽基因中插入阿泊拉抗性基因（lat：：apr）的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌地基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。     

球孢链霉菌质粒pSGL1的性质研究

链霉菌质粒pSGL1是本实验室在球孢链霉菌（Streptomycelglobisporus）中发现的新的质粒,它可以在变铅青链霉菌中复制。用缺失分析确定了pSGL1的基本复制区位于一个2．0kb的片段上。pSGL1能够与pIJ101相容。pSGL1是一个高拷贝质粒,拷贝数约为70～250。在对质粒进行分析的过程中得到的一些衍生质粒如pSGLN和pSGLS3等可以作为新的链霉菌基因克隆载体,并可用于构建新的高效分泌表达的链霉菌载体。     

林可链霉菌黑色素生物合成基因的克隆与表达

以pIJ702的melCl－C2基因为探针杂交林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）78－11染色体DNA,呈现出3．2kb的BamHI片段和2．6kb的SphI片段等一系列阳性条带。构建了含3．0～3．5kbBamHI片段的林可链霉菌78-11基因文库,从中分离克隆了黑色素生物合成基因melCl和melC2,并测定了含有mel基因的重组子pRSB336插入片段的全部DNA顺序。3152bpBamHI片段含有5个开放阅读框架,其中melCl和melC2与链霉菌属三个种的相应基因具有较高的同源性。此外,林可链霉菌78－11的melC2基因产物与人和鼠的酪氨酸酶轻微同源,分别为17．3％和24．5％。种种迹象表明,melCl、melC2和orf3组成黑色素生物合成操纵子结构。为了进一步鉴定上述克隆的林可链霉菌78-11黑色素生物合成基因,构建了分别含有新霉素抗性基因启动子和正反方向mel基因的重组质粒pPZ518和pPZ519,并转化变铅青链霉菌TK23。随机挑选的12个pPZ518转化子在R2YE培养基上均能分泌淡褐色色素,而所有的pPZ519和pES1转化子则都呈白色。     

变铅青链霉菌启动子的克隆和表达

利用启动子探测质粒pIJ486(Tsr~(?) Neo~(?))将变铅青链霉菌(streptomyces lividans)TK24染色体DNA的BamHI酶切片段插入pIJ486的BamHI位点。获得4个硫链丝菌肽抗性、新霉素抗性的重组质粒。它们分别命名为pMGI(10.6kb)、pMG40(7.6kb)、pMG50(10.8kb)和pMG88(7.92kb)。BamHI酶切分析及再转化试验表明,新霉素抗性的恢复确实来自载体的外源插入序列。用BgⅢ酶切已将pMG40的插入序列缩小到0.78kb的pMG40-2,pMG50的插入序列缩小到2.2kb的pMG50-25,仍保留启动子活性。重组质粒pMG50-25的新霉素抗性水平高达90μg/ml(卡那霉素抗性水平为500μg/ml),表明这是一个活性很强的启动子。     

林可链霉菌中的同源重组

为研究链霉菌中的同源整合频率和机制 ,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE0 4a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组 ,经过低抗筛选 ,得到两个突变子S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASmaⅠ片段 ,S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2都得到 1 5kb的阳性条带 ;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段 ,只有S .lincolnensisYY2得到 4 4kb的阳性条带。Southern杂交结果表明S .lincolnensisYY1是由同源交换或二次重组产生的 ,而S .lincolnensisYY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在 ,用SphⅠ酶切染色体DNA后连接 ,连接液转化E .coliJM83感受态细胞 ,在氨苄抗性板上得到 2个转化子 ,命名为pSLE1。对…     

一个热诱导穿梭表达载体的构建及其在链霉菌中的应用

为探索大肠杆菌λ噬菌体表达调控元件在链霉菌中的应用,构建了一个链霉菌大肠杆菌穿梭表达载体pHZ1080,并将来自链霉菌FR-008的聚酮合酶(PKS)基因置于其中的λ噬菌体启动子P_R下游,得到表达PKS的穿梭质粒pHZ1067。与在大肠杆菌中一样,该质粒在变铅青链霉菌中也受热诱导表达100kD的PKS蛋白;表达的PKS蛋白可由SDSPAGE和Western-blot实验检测到。PKS在链霉菌中的热诱导表达表明,构建的载体也能用于链霉菌诱导表达外源基因。       

链霉菌高拷贝质粒pIJ101的研究 V．两个拷贝数突变子及其与克隆片段的关系

在分离和定位链霉菌高拷贝质粒PlJ101上启动子活性区域的过程中,我们将Bc11-E片段经MboI进一步酶解后,克隆到由pIJ101基本复制功能区所衍生的载体pIJ425的BgIII位点上,从转化酶、铅青链霉菌TK64以原生质体所获得的硫链丝菌素抗性转化子中,发现了两个拷贝数极其异常的衍生质粒,命名为PI J2743和PIJ2744。与plJ425相比,pIJ2743的拷贝数增加约10倍,而pIJ2744的拷贝数则降低约10倍。拷贝数的剧增和剧减不是由于质粒宿主的突变,因为它们在重新转化的宿主中仍显示了突变型拷贝数特征。拷贝数的变化也不是由于载体的突变,因为切除插入片段后,载体区域再连接后的质粒仍与原始plJ425的拷贝数相同。将高拷贝突变子中0.63kb的插入片段以两种不同的取向克隆到另一个类似于pIJ425的载体p1J 486的BamHI位点,在一种取向插入时,新衍生的质拉仍显示出投高的拷贝数,而在另一种取向时,质粒的拷贝数不发生变化,说明拷贝数的剧增不仅只与插入片段有关,而且其功用具有明显的方向性,即为-顺式作用因子。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101的分子生物学

pIJ101是一个8.9kb的高拷贝链霉菌质粒,在载体的构建和应用方面得到了广泛的应用。pIJ101具有质粒大小适中,在接合时能够自我转移和诱动染色体的能力强,具有清晰的"麻点"形成特征,并在接合时的供受体双方均携带有pIJ101时没有"进入不利"的属性。通过缺失分析,已确定了与接合转移、麻点形成、复制功能及质粒稳定性等功能区。本文对pIJ101分子生物学研究和应用的进展进行系统综述。     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/HindⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后回收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3.3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100%,解离后的质粒稳定性为93%。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

头状轮生链霉菌中丝裂霉素C抗性基因的克隆及功能研究

头状轮生链霉菌(\%Streptoverticillium caespitosus\%)ATCC27422是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌,实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素C敏感的阻断变种S6,并以它为受体宿主,以质粒pIJ699为载体,建立野生型头状轮生链霉菌菌株ATCC27422的基因库。采用鸟枪法克隆技术,从库中筛选获得含有丝裂霉素C抗性基因的62kb外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒pLX5导入变铅青链霉菌(\%Streptomyces lividans\%)获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将pLX5导入野生型菌株中,使其对丝裂霉素C的抗性大幅度提高：最低抑制浓度(MIC)由原来的200μg/mL上升至1000μg/mL以上。摇瓶发酵实验表明：单位菌量的ATCC27422(pLX5)的丝裂霉素产量高于野生菌株ATCC27422,因此丝裂霉素C抗性与产量之间存在一定的相关性。     

扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl2/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。