荷包猪一类缺失型SLA-3等位基因的克隆及生物信息学分析

为研究荷包猪SLA-3基因特征,设计引物克隆了荷包猪SLA-3,经生物信息学软件分析其基因特征。结果显示,所克隆的荷包猪SLA-3基因(暂命名为SLA-3-HB02)碱基序列长度为1 417 bp,其中2-1 054为ORF区,共编码350个氨基酸,在其编码的氨基酸334-344处存在缺失。SLA-3-HB02与其他SLA-3、SLA-2及SLA-1等位基因群的氨基酸同源率分别为87.8%-98.6%、82.8%-87.8%和83.7%-90.0%。分子进化关系分析,SLA-3-HB02与美国的Hanford遗传距离较近;各功能区分析,SLA-3-HB02保留了HLA-A2等的部分功能基因位点,并与HLA-B15和H-2K1有一定的交叉识别位点。同源模建揭示SLA-3-HB02分子与HLA-A2及H-2K1 3D结构相似。     

我国巴马小型猪SLA-2基因克隆及分子特征

为研究我国巴马小型猪SLA-Ⅰ分子特征,设计引物克隆了SLA-Ⅰ类分子SLA-2基因(SLA-2bm),并通过分子生物学软件分析其分子特征。经克隆及序列测定分析,SLA-2bm为1119bp,其中3~1097为ORF区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示SLA-2bm与其它SLA-2、SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为88.4%~96.4%、88.3%~90.5%和87.7%~92.7%。系统进化树显示SLA-2bm与其它SLA-2等位基因在遗传关系上相对独立,进化程度较低;各功能区分析,SLA-2bm与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点。结果表明,SLA-2bm属于一个新的等位基因,巴马小型猪是保留原始基因特征的品种。     

GGTA1~(-/-)五指山小型猪SLAI类基因分子特征及与HLA相似性分析

目的明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型猪SLA经典I类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。方法采集6头祖代GGTA1-/-五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLA I类基因(SLA-1、SLA-3、SLA-2)扩增、克隆及测序,对序列进行BLAST分析,并采用生物信息学方法对SLA I类基因分子结构特征及其与人HLA的同源性进行分析。结果测序分析表明,共获得6条等位基因序列,其中4条为已公布的等位基因(SLA-1*0703、SLA-2*1102、SLA-3*0401、SLA-3*0403),另2条为新等位基因(SLA-1*0401wz01、SLA-2*11wz01)。五指山小型猪与人HLA同源性为70.5%~72.1%。SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-2*11wz01、SLA-2*1102和SLA-3*0401的CD8+分子识别的关键结合域与人HLA氨基酸序列比对,均仅在位点225、228处发生了突变(T→S、T→M),其他位点高度保守。SLA-2*11wz01和SLA-2*1102与人HLA I类基因NK细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor,KIR)结合区氨基酸同源性较高,在NKTA-1亚型结合域内仅有1个氨基酸差异,而在NKTA-2和NKTA-3亚型结合域内有2个氨基酸差异。结论从免疫细胞介导的异种排斥反应角度出发,GGTA1-/-五指山小型猪SLA I类基因氨基酸序列与人HLA高度相似,可作为未来猪-人异种器官移植的良好供体之一。     

可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。     

托佩克猪SLA-3原核表达载体构建及表达

目的:研究托佩克猪SLA-3-TPK的原核表达载体的构建及蛋白表达。方法:设计引物扩增SLA-3-TPK胞外区(命名为SLA-3-TPKe),并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector,经双酶切筛选阳性克隆测序,序列正确的克隆片段与表达载体p ET-21a(+)连接,转化宿主菌BL21,并经过诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果:PCR成功扩增获得SLA-3-TPke,大小约为850bp,酶切后插入片段大小约为830bp,经克隆测序,阳性克隆序列与原序列一致,双酶切鉴定证实目的基因与p ET-21a(+)成功连接,经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测,结果显示目的基因成功表达且目的蛋白大小约为31k Da。结论:该研究成功构建了托佩克猪SLA-3原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

猪CFL2b 基因cDNA克隆初步分析

利用基因表达谱芯片分析法筛选出与大白猪高肌肉产量-肌纤维形成有关的CFL2b基因.参考人和小鼠CFL2b基因序列,采用SMART-RACE技术结合EST序列拼接技术,从猪骨骼肌肌肉中首次克隆了猪CFL2b的全长cDNA序列（GenBank登录号EU561660,EU561661）,Northern杂交检测CFL2b基因 mRNA.结果表明,猪CFL2b基因含有2个转录本,长转录本3　012 bp,短转录本1　466 bp .CFL2b基因在多种真核生物中都有表达,且编码区序列非常保守,开放式读码框501 bp编码了166个氨基酸的蛋白质.氨基酸序列分析表明,猪CFL2基因与人和小鼠氨基酸同源性分别为100%和99.1%.核苷酸序列相似性分别为88.1%和74.9%.     

山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析

旨在克隆山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)基因cDNA全序列并进行序列分析.提取山羊睾丸中总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增山羊PHGPx基因cDNA序列并对其生物信息学进行分析.结果表明,山羊PHGPx基因cDNA序列全长844 bp,共编码199个氨基酸;山羊与牛、猪、人和小鼠的氨基酸序列同源性均大于90％;山羊PHGPx蛋白二级结构功能区域属谷胱甘肽过氧化物酶家族,预测23-24和28-29氨基酸位点有潜在的信号肽位点;UPGMA算法构建该物种间分子系统进化树,山羊与牛先聚为一类,再分别与猪、鼠、人、鸡聚类,最后与蜜蜂聚类,与物种动物学分类基本吻合.首次克隆了山羊PHGPx基因,具有GSH-Px家族典型特征,研究结果将为PHGPx基因表达分子调控研究提供一定的理论依据.     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

小型猪CYP3A88基因克隆与其他动物的序列比较

目的克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析。方法应用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析。结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88（GenBank登录号：EF625347）的编码区,获得大小为1965bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员（CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22）进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39～491氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构。结论在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的最为相似。     

我国巴马小型猪SLA-2基因克隆及分子特征

为研究我国巴马小型猪SLA-Ⅰ分子特征,设计引物克隆了SLA-Ⅰ类分子SLA-2基因（SLA-2*bm）,并通过分子生物学软件分析其分子特征。经克隆及序列测定分析,SLA-2*bm为1119bp,其中3～1097为ORF区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示SLA-2*bm与其它SLA-2、 SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为88.4%～96.4%、88.3%～90.5%和87.7%～92.7%。系统进化树显示SLA-2*bm与其它SLA-2等位基因在遗传关系上相对独立,进化程度较低;各功能区分析,SLA-2*bm与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点。结果表明,SLA-2*bm属于一个新的等位基因,巴马小型猪是保留原始基因特征的品种。