棉铃虫β-微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

β-微管蛋白是构成细胞骨架的重要组成性蛋白,对昆虫的蜕皮、器官形成等生长发育阶段均能产生重要影响。本文以棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)3日龄成虫为材料,利用RACE末端扩增技术克隆得到棉铃虫的β-微管蛋白基因的cDNA序列。序列分析表明:棉铃虫β-微管蛋白基因的cDNA序列包含1775个碱基,包括一个1347个碱基的开放阅读框,编码448个氨基酸组成的多肽。GenBank登录号:JF767013。同源性分析表明,棉铃虫的微管蛋白基因与本研究所比对其它昆虫的β-微管蛋白基因具有高度的同源性,达到90%左右。本研究克隆得到棉铃虫的β-微管蛋白基因的cDNA序列,对进一步深入研究该基因功能有重要意义。     

二化螟β1微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

微管是真核生物体内分布最为广泛的一类蛋白,是由a-和β-两种不同的微管蛋白组成的异源二聚体.微管参与许多细胞功能,如细胞形态发生、细胞生长和分裂等.以二化螟3龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到该虫的β微管蛋白基因的cDNA序列一条.cDNA序列含1 862个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2kD,等电点4.82.氨基酸序列中1～4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,是微管蛋白特异片段;氨基酸序列的140～146GGGTGSG位存在一个微管蛋白标志信号片段.序列比对表明,克隆的β微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,与家蚕Bombyx moriβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.1%,与烟草天蛾β1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与果蝇Drosophila melanogasterβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到96.9%.该基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号为EU429675.     

小地老虎UV视蛋白基因的克隆及序列分析

视蛋白是感光物质的重要组成成分,是动物感知周围光环境的重要途径之一。本文以小地老虎(Agrotis ypsilon)3日龄成虫为材料,利用RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆得到小地老虎UV视蛋白基因的cDNA序列。序列分析表明,小地老虎视蛋白基因的cDNA序列1 632 bp,包括一个1 140 bp的完整开放阅读框架,编码379个氨基酸,理论蛋白分子量(Mw)41.50 ku,等电点(pI)7.56。GenBank登录号为JN185654。UV视蛋白包括7个跨膜拓扑结构和一个G蛋白偶联受体家族,第107位赖氨酸与UV视蛋白的紫外敏感性有重要关系。同源性分析显示,小地老虎UV视蛋白基因与其他昆虫的UV视蛋白基因具有较高同源性。本研究对深入探究UV视蛋白在动物夜行生活中的作用具有重要意义。     

哈茨木霉β微管蛋白基因的克隆与序列分析

根据哈茨木霉T88菌丝体cDNA文库中的β微管蛋白基因EST序列,采用反向PCR方法以哈茨木霉T88的基因组DNA为模板,扩增得到了1.74kb的β微管蛋白基因编码区、1.5kb的5′非编码区和1.0kb的3′非编码区。哈茨木霉β微管蛋白基因编码446个氨基酸,与其它真菌β微管蛋白基因具有较高的序列同源性。对哈茨木霉β微管蛋白的三维结构进行了同源建模,模建的结果为研究哈茨木霉β微管蛋白自身特性及其与抗微管类杀菌剂的作用机制提供了分子基础。     

三种鳞翅目夜蛾科昆虫α-微管蛋白基因的克隆与mRNA表达水平

根据昆虫微管蛋白的分子特征筛选对昆虫微管有效的抑制剂来控制昆虫的生长发育或不同器官的有效功能的表达来达到控制害虫的目的,在未来的害虫综合治理中具有广泛的应用前景。以预蛹期甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小地老虎Agrotis ypsilon和八字地老虎Agrotis c-nigrum为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到以上3种夜蛾科昆虫的α-微管蛋白基因的cDNA序列,3种昆虫的该基因序列均包括1个1353个碱基的开放阅读框。这3个cDNA序列均编码1个含450个氨基酸的蛋白,分子量约为50kDa。氨基酸的142~148位存在1个微管蛋白信号片段GGGTGSG,在氨基酸序列的C-端都有1个酪氨酸残基,N-端存在1个对转录后调控非常重要的保守区MRECI序列,以上特点与其他昆虫α-微管蛋白氨基酸序列保守区序列相同。序列比对表明,克隆得到的α-微管蛋白基因的核苷酸序列是高度保守的,同源性为94.4%~97.0%,而氨基酸的序列同源性达到100%。利用RT-PCR技术在3种昆虫4龄、5龄、6龄幼虫、蛹期4个不同发育阶段和6龄期的肠道、体壁、脂肪体3种不同组织中都检测到了α-微管蛋白基因在mRNA水平的表达。     

千里光β-微管蛋白基因结构与功能的生物信息学分析

β-微管蛋白是影响细胞新陈代谢和行使功能的重要结构物质,研究β-微管蛋白基因的序列信息对揭示其蛋白结构与功能具有重要指导意义。从千里光全长cDNA文库中分离得到β-微管蛋白基因,并采用生物信息学软件进行序列分析。结果显示,该基因长度为1750 bp,编码的蛋白质长度为448个氨基酸,与柚子β-微管蛋白的同源性最高,达96%;其蛋白质分子量为50.01 kD,理论等电点为4.83。β-微管蛋白二级结构主要组成为无规则卷曲结构和α螺旋结构;结构域分析发现该蛋白具有两个保守结构域;三级结构预测为相对稳固的类球形结构;信号肽分析将该蛋白主要定位于细胞质、过氧化物酶体、线粒体基质等亚细胞器位置。将该基因序列上传至GenBank所获得的登录号为KF887495。本实验结果为千里光β-微管蛋白的作用机制揭示和应用研究提供了基础数据,也为植物β-微管蛋白基因的分子研究提供了理论依据及基础资料。     

水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)β-微管蛋白基因克隆及与多菌灵抗药性关系

【目的】揭示水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)对多菌灵的抗药性与其β-微管蛋白基因的相关性。【方法】结合形态学和TEF-1α基因序列对分离菌株进行鉴定;根据近源种拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)核基因组测序菌株7600的β-微管蛋白核苷酸序列设计引物,采用PCR方法克隆并比对分析了F.fujikuroi对多菌灵不同敏感性表型的5个菌株的β-微管蛋白基因全序列;利用实时定量技术(qRT-PCR)分析了β-微管蛋白基因在上述5个菌株中的表达特性。【结果】F.fujikuroi的β-微管蛋白基因核苷酸序列(GenBank登录号:JQ026022)全长1671 bp,包含4个内含子,编码447个氨基酸残基;2个敏感性菌株和3个抗药性菌株的β-微管蛋白基因核苷酸序列同源性100%;在无药剂处理下该基因在2个敏感性菌株中的表达水平显著高于3个抗药性菌株(p=0.05),且对同一菌株而言,药剂处理能够显著提高β-微管蛋白基因表达水平(p=0.05),但在相同药剂处理条件下,菌株间差异不显著。【结论】F.fujikuroi对多菌灵的抗药性机制与β-微管蛋白无关,有待进一步研究。     

小地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因cDNA序列的克隆及mRNA组织特异性表达

β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是昆虫几丁质代谢中一种关键酶,在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。本文以小地老虎Agrotis ipsilon Hufngel预蛹期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到其β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。该序列含有2701个碱基,包括一个1788个碱基的开放阅读框,编码一个含595个氨基酸的蛋白,分子量约为68.3ku,等电点为5.48。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶高度同源。基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU985280。该基因在小地老虎取食期和预蛹期的马氏管、中肠、脂肪体、体壁和去中肠虫体中均含有mRNA水平的表达。     

柳树β微管蛋白基因家族的克隆和序列分析

该研究克隆鉴定了旱柳和龙爪柳β微管蛋白基因,并对其进行了序列相似性、系统发育、染色体定位以及表达模式的分析。结果显示,2种柳树β微管蛋白基因家族各有20个成员,家族内部成员间核酸和氨基酸序列相似性分别在74.0%和86.6%以上,种间同源蛋白氨基酸序列相似性在85.8%以上,柳树与其它植物β微管蛋白间的氨基酸序列相似性在81.5%以上。系统发育分析显示,柳树β微管蛋白家族被分为4个亚组,结合杨树β微管蛋白基因染色体定位,推测柳树β微管蛋白基因家族经历了杨柳科全基因组重复事件和串联重复事件,而柳树TUB11和TUB12可能来源于区段重复或者转座。基因表达模式分析发现,该家族成员的表达具有一定的组织特异性,并且部分重复基因对在所检测组织中表达差异较大。柳树β微管蛋白基因家族成员序列的高度相似性、成员数量的进化扩张、以及表达模式的多样性可能赋予了细胞分裂与生长更高的灵活性,这对多年生木本植物的生长发育习性意义重大。     

禾谷镰孢菌β-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系的分析

应用3对引物,从禾谷镰孢菌(Gibberella zeae)对多菌灵(MBC)的敏感菌株(MBC^R)和田间及室内诱导抗药性菌株(MBC^R)中扩增β-微管蛋白基因。该基因全长1631bp,包含3个内含子,编码447aa,与其他常见植物病原丝状真菌β-微管蛋白基因的氨基酸同源性达95．12％～99．30％。MBC^R和MBC^R菌株核苷酸序列分析表明,MBCR菌株未发生任何位点的突变,说明G．zeae对MBC的抗药性机制并非像其他丝状真菌一样由β-微管蛋白198位氨基酸突变所致。     

小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白序列无关析

[目的]研究小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白基因的相关性.[方法]比较对多菌灵不同敏感性水平菌株间在药剂作用下的形态学特征及其α2-微管蛋白基因异同.[结果]当敏感菌株和田间中抗菌株均在各自EC50和EC90浓度作用下,两者分生孢子芽管和初生菌丝均表现畸形,肿胀,分支增多.根据小麦赤霉病菌核基因组测序菌株NRRL31 084(PH-1)的α2-微管蛋白基因核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法克隆并测定了小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)不同敏感性表型的8个中国菌株的α2-微管蛋白基因全序列.DNA序列比对结果表明中国的4个敏感菌株和4个抗药性菌株的α2-微管蛋白基因核苷酸序列同源性没有差异,多菌灵抗药性与α2-微管蛋白无关.该基因全长1712 bp,含有4个内元,编码453 aa;与NRRL31 084的α2-微管蛋白基因核苷酸序列同源性为99%,存在5个差异核苷酸,与其所编码的氨基酸序列同源性为100%;与其他9种真菌α2-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为64%～89%.[结论]小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白序列无关.     

γ-微管蛋白研究进展

概述了近年来对γ-微管蛋白复合体结构、分子机制以及功能的研究进展.γ-微管蛋白是真核生物体内一种重要的保守性功能蛋白,以γ-微管蛋白小复合体和γ-微管蛋白环式复合体两种形式存在.通过γ-微管蛋白复合体结合蛋白定位于微管组织中心,参与微管的晶核起始以及有丝分裂纺锤体的组装等细胞功能.     

生物体内的γ-微管蛋白

γ-微管蛋白在真核生物体内以γ-微管蛋白环式复合体和γ-微管蛋白小复合体两种形式存在.γ-微管蛋白在真核生物体内的主要功能是参与微管晶核形成、有丝分裂纺锤体的形成以及细胞周期调控等.该文重点介绍植物体内的γ-微管蛋白所行使的功能.     

γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟和活化中的分布

微管蛋白(tubulin)是一蛋白质超家族,其中α-,β-微管蛋白是主要的微管蛋白,而γ-微管蛋白主要在微管组装中起作用. 我们利用蛋白质印迹和激光共聚焦技术研究了γ-微管蛋白在猪卵母细胞成熟、受精和活化中的分布. γ-微管蛋白存在于猪卵母细胞中,并且在减数分裂成熟各个时期的量保持不变. 它聚集在微管上,特别是中期纺锤体的两极和后末期的中板. 体外受精和孤雌活化后,γ-微管蛋白聚集在雌雄原核的周围.另外它也存在于精子的顶体帽和颈部.在早期卵裂中,γ-微管蛋白聚集在胚胎的细胞核周围.实验结果表明,γ-微管蛋白在猪卵母细胞、精子和胚胎的微管组装中起重要的调节作用,在猪受精过程中,精子和卵子都向受精卵贡献中心体物质.     

甘蓝夜蛾和八字地老虎肌动蛋白基因的克隆与序列分析

肌动蛋白是细胞骨架微丝的主要组成成分,在肌肉收缩、细胞骨架形成、细胞移动等方面起重要作用。以鳞翅目夜蛾科昆虫甘蓝夜蛾Mamestra brassicae L.和八字地老虎Agrotis c-nigrum 3龄幼虫整个虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到2种昆虫的肌动蛋白的cDNA序列,甘蓝夜蛾肌动蛋白的cDNA序列含有1441个碱基,而八字地老虎肌动蛋白的cDNA序列含有1411个碱基。2种昆虫的该基因的cDNA序列均包括1个1131个碱基的开放阅读框,编码1个含376个氨基酸的蛋白。甘蓝夜蛾肌动蛋白分子量约为41.8kDa;八字地老虎肌动蛋白分子量约为41.9kDa。Prosite软件分析结果表明,甘蓝夜蛾和八字地老虎肌动蛋白氨基酸序列中存在3个肌动蛋白特征片段。GenBank数据库搜索及序列比对结果表明,甘蓝夜蛾肌动蛋白属于肌肉特异型肌动蛋白,八字地老虎肌动蛋白属于细胞质特异型肌动蛋白。2个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,甘蓝夜蛾肌动蛋白cDNA序列登录号为EU035314,八字地老虎肌动蛋白cDNA序列登录号为EU035315。利用RT-PCR技术在八字地老虎4龄、5龄、6龄幼虫、蛹期4个不同发育阶段和6龄期的肠道、体壁、脂肪体3种不同组织中都检测到了肌动蛋白基因在mRNA水平的表达。     

.用酵母双杂交系统筛选CENP-E相互作用蛋白

纺锤体检验点(spindle checkpoint)是一个重要的细胞分裂生化调节通路, 可监督染色体正确分离和传代．着丝粒相关蛋白E (centromere-associated protein E, CENP-E)是一个分子量为312 kD的微管马达驱动蛋白,可以衔接纺锤体微管与动点并参与纺锤体检验点调控．为研究CENP-E的作用机理,以其动点结合区域为诱饵蛋白,用酵母双杂交技术从人HeLa细胞 cDNA 文库中筛选出了Nuf2蛋白．体外的pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验表明, Nuf2蛋白通过其卷曲螺旋(coiled-coil) 功能域特异结合CENP-E的 C 末端区域,间接免疫荧光显示Nuf2与CENP-E共定位于细胞有丝分裂期染色体的动点．由此推论, CENP-E 通过Nuf2的直接作用参与构筑动点-微管界面,进而参与细胞有丝分裂纺锤体检验点信号转导通路,为染色体正确分离发挥调控作用．     

八字地老虎和粘虫蜕皮激素接受子3(HR3)基因cDNA序列的克隆与序列分析

蜕皮激素接受子3(hormone receptor 3,HR3),是一种蜕皮调节转录因子,调控蜕皮过程中相关基因的表达,是蜕皮级联反应中的关键因子。本文以八字地老虎Agrotisc-nigrumL.和粘虫Mythimna separata Walker预蛹期幼虫为材料,分别提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到2种昆虫蜕皮激素接受子3(HR3)的5′非编码区和完整开放读码框在内的cDNA序列,其中八字地老虎的HR3 cDNA序列含有1729个碱基,包括一个1533个碱基的开放阅读框,编码一个含510个氨基酸的蛋白,分子量约为57.5ku。粘虫的HR3cDNA序列含有1743个碱基,包括一个1536个碱基的开放阅读框,编码一个含511个氨基酸的蛋白,分子量约为57.9ku。这2种昆虫HR3 cDNA序列推导的氨基酸序列均具有昆虫核受体超家族特征性结构域,与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的蜕皮激素接受子3的氨基酸序列高度同源。获得的基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,八字地老虎HR3登录号为GU188853,粘虫HR3登录号为GU188854。     

八肋游仆虫微管蛋白基因家族的鉴定及进化分析

为了系统分析八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)微管蛋白基因家族, 从八肋游仆虫大核基因组中共鉴定得到20个微管蛋白基因, 基于同源比对及系统进化分析, 将其归入α、β、γ、δ、ε及η六个微管蛋白亚家族; 多序列比对及Western blot结果显示八肋游仆虫η微管蛋白基因在翻译过程中需发生一次+1位编程性核糖体移码, 其移码位点为AAA-TAA; 所有自由生纤毛虫都含有多个α和β微管蛋白基因亚型, 可能用于组成不同的微管结构。研究为后续深入探讨八肋游仆虫微管蛋白的生物学功能及微管多样性奠定了基础。     

三种多菌灵耐药性链格孢属真菌β-tubulin基因的序列特征

应用两对引物,从对多菌灵具有耐药性的链格孢属3个真菌中扩增了与多菌灵耐药性相关的β-微管蛋白基因,基因长度分别为1,419bp（瓜链格孢）,1,426bp（茄链格孢）,1,419bp（链格孢）,均包含3个内含子,编码398个氨基酸。3个链格孢属真菌与其他对多菌灵敏感的植物病原真菌β-微管蛋白氨基酸具有高度的同源性。但是,3个真菌167位氨基酸均为酪氨酸,而其他对多菌灵敏感的真菌167位均为苯丙氨酸,研究结果表明链格孢属真菌对多菌灵的耐药性可能与167位酪氨酸有关。     

鳜鱼Mx蛋白全长cDNA的克隆和序列分析

Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白.本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)的鳜鱼为材料,提取肝脏总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列,再应用3'和5'快速扩增cDNA末端(RACE)方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端,最终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列(GenBank登陆号AY392097).序列分析表明鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp,其中编码区长1881bp,编码627个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为7.15kDa.鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD);一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS/KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构域.鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制,以及干扰素的检测奠定了基础.