人天然免疫基因BCL10的猪同源物的识别、克隆与初步表达分析

采用电子克隆方法克隆到大小为925 bp的人天然免疫蛋白BCL10的猪同源基因完整cDNA序列(GenBank登录号：EU088132), 并利用RT-PCR方法从猪的全血中扩增出包含702 bp的完整开放读码框架(ORF)的cDNA片段。经核酸测序, 证明与电子克隆结果相符。利用NCBI BLAST分析该cDNA包含3个大小为57 bp、289 bp和356 bp的外显子, 并且定位于猪的4号染色体上。采用半定量PCR技术检测基础水平猪各组织BCL10基因mRNA表达丰度, 并将该基因构建到带有绿色标签的真核表达载体pEGFP-C1中, 采用脂质体转染法将该基因转入PK-15细胞, 通过绿色荧光标记和RT-PCR方法检测实验组的BCL10蛋白表达。研究结果表明, BCL10基因mRNA在脾脏中表达最高; 胸腺、大脑和淋巴结表达次之, 而肝脏只有微量表达, 肾脏没有检测到表达; 同时BCL10基因在PK-15细胞中得到了有效表达。     

银鲫两个蛋白合成相关基因全长cDNA的克隆及其特征分析

通过构建雌核发育银鲫心跳期SMART cDNA质粒库并从库中随机挑选克隆测序,克隆得到银鲫翻译起始因子3亚单位2(GTIF3—S2)和翻译延伸因子1亚单位α(GEF-1α)基因全长cDNA。银鲫翻译起始因子3亚单位2基因cDNA全长1280bp,开放阅读框位于117—1091bp之间,编码325个氨基酸。其推断的氨基酸序列存在三个WD结构域。该基因在鱼类中为首次报道。银鲫翻译延伸因子1亚单位alpha基因cDNA全长1784bp,开放阅读框位于82—1467bp之间,编码462个氨基酸。RT-PCR表明,这两个基因在成熟卵母细胞和胚胎发育早期可以检测到少量的转录产物,在胚胎发育期间从原肠期开始转录,并随着发育进程逐渐增强。成鱼组织中除精巢表达较弱外,其他组织都表达较强。同源分析比较表明,TIF3-S2和EF-1α在物种进化过程中具有高度的进化保守性,在物种间的同源性很高。因此,作认为,这两个基因是研究物种间系统发育的优良对象。     

人甲状腺受体相互作用蛋白15基因全长cDNA的克隆及其特性

通过生物信息学分析及RT PCR技术 ,从人垂体cDNA文库中克隆到甲状腺素受体相互作用蛋白 15(hTRIP15)的全长cDNA ,长度 1963bp ,编码 4 4 3氨基酸 ,同时克隆该基因不同剪接方式所形成的新的异构体 ,长度 1984bp ,编码 4 50氨基酸 .与基因组序列比较显示该基因具有 12个外显子 ,5号外显子 3′端具有 2个剪切的接点 (-ag) .搜寻UniGene数据库作染色体定位于D15S146 D15S117,该基因在生物进化上具有较高的保守性 ,从单细胞藻类到人类均有该基因同源物表达 ,亚细胞定位为核内 .Northern杂交显示 ,该基因具有 3种不同大小的转录本 ,分别约为 2 0、3 5及 4 0kb ,且在人体各组织中均有一定表达 ,其中骨骼肌、心脏及肾脏组织为高表达 .半定量RT PCR显示在一些内分泌组织均有表达 ,以肾上腺较高 .     

金鱼PP2A-B′家族δ基因cDNA的克隆及表达分析

通过3′-RACE及5′-RACE技术克隆得到了金鱼蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A,PP2A)调节亚基B′家族δ(Delta)基因的cDNA全序列.结果显示,金鱼δ基因cDNA全长2415bp,编码一个含555个氨基酸的蛋白.序列分析表明,该基因编码的蛋白与已知其他物种对应的B′家族蛋白质均有着很高的同源性.RT-PCR分析证明,该基因mRNA表达水平在大脑中为最高,肝脏、精巢、卵巢、肾脏和鳃中次之,鳍中最少.在不同胚胎时期中,两细胞期、多细胞期、囊胚期和原肠胚期表达最高,其他时期相对较低.在蛋白水平上,精巢、卵巢、大脑和心脏中最高,肝脏中次之,肾脏、鳃和鳍中最少.在胚胎中,两细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期和神经胚期及视原基期表达最高,脑泡分化和眼色素期表达量最少.由此可以推测PP2AB′-δ基因在金鱼不同组织和胚胎发育的不同时期中可能起着多种重要作用.     

兔早期胚胎发育相关新基因IFRG的克隆和表达

近来的研究表明干扰素在哺乳动物早期胚胎发育中有重要的作用。我们首次克隆了兔早期胚胎发育相关新基因IFRG（干扰素应答基因）的全长cDNA序列（AJ584672）,根据该cDNA序列以兔卵巢cDNA为模板经PCR扩增后克隆了兔IFRG cDNA的完整开放阅读框(396bp)。将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,在大肠杆菌BL21中进行了GST-IFRG融合蛋白的表达。 经IPTG诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测结果显示在41kDa处有特异性表达蛋白,回收融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体,通过Western杂交表明该融合蛋白具有生物免疫活性。     

金鱼PP2A-B′家族δ基因cDNA的克隆及表达分析

通过3′-RACE及5′-RACE技术克隆得到了金鱼蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A,PP2A）调节亚基B′家族δ（Delta）基因的cDNA全序列.结果显示,金鱼δ基因cDNA全长2415bp,编码一个含555个氨基酸的蛋白.序列分析表明,该基因编码的蛋白与已知其他物种对应的B′家族蛋白质均有着很高的同源性.RT-PCR分析证明,该基因mRNA表达水平在大脑中为最高,肝脏、精巢、卵巢、肾脏和鳃中次之,鳍中最少.在不同胚胎时期中,两细胞期、多细胞期、囊胚期和原肠胚期表达最高,其他时期相对较低.在蛋白水平上,精巢、卵巢、大脑和心脏中最高,肝脏中次之,肾脏、鳃和鳍中最少.在胚胎中,两细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期和神经胚期及视原基期表达最高,脑泡分化和眼色素期表达量最少.由此可以推测PP2AB′-δ基因在金鱼不同组织和胚胎发育的不同时期中可能起着多种重要作用.     

心脏特异新基因Lrrc10的分子克隆与特性分析

采用表达序列标签(EST)介导的基因克隆和表达谱分析,从小鼠心脏克隆了一个心脏特异新基因Lrrc10（GenBank Acc No. AF527781）.该基因cDNA全长为1 410 bp,定位于小鼠染色体10D2,在基因组中无内含子.Lrrc10的最大开放阅读框编码的假想蛋白由274个氨基酸组成,含有7个亮氨酸重复基序.同源性检索未发现有整体同源性的已知基因.EST数据库中支持该基因cDNA序列的全部18条EST均来自小鼠心脏组织.对小鼠的不同组织cDNA的RT-PCR检测证实该基因主要在心脏中强表达,在肺低表达,而在其他组织中不表达或表达很弱.因此该基因是心脏特异的富亮氨酸重复超家族新成员.     

猪Btnl5基因的克隆、表达分析及对NF-κB信号通路的调控作用

猪类嗜乳脂蛋白5(Btnl5)属于嗜乳脂蛋白家族,其同源蛋白多为免疫调节蛋白,为探索Btnl5的序列特征及其功能,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术对Btnl5基因cDNA全长进行克隆及序列分析,采用定量PCR技术检测Btnl5在猪不同组织中的表达丰度,利用报告基因法检测Btnl5对NF-κB信号通路的影响。克隆得到Btnl5基因cDNA全长共3 334 bp,包含1 680 bp的开放读码框,可编码长度为559个氨基酸残基的多肽链。蛋白结构预测表明Btnl5编码的蛋白含有信号肽、两段免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和B30.2结构域。定量PCR分析表明,在检测的11个组织中,Btnl5只在空肠中具有较高水平的表达。报告基因检测结果显示Btnl5对NF-κB信号通路有一定的抑制作用。研究结果说明,Btnl5可能通过抑制NF-κB信号通路参与调节肠道免疫。     

猪I-FABP基因的分子克隆与组织特异性表达分析

小肠型脂肪酸结合蛋白对长链脂肪酸具有高度的亲和力,参与脂肪酸的吸收和细胞内转运。利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术并结合同源克隆策略,克隆到了编码猪小肠型脂肪酸结合蛋白基因（I-FABP）的全长cDNA序列（GenBank接受号：AY960624）,并对系统发育关系等进行了生物信息学分析。猪I-FABP基因的cDNA序列全长614 bp,其中包括399bp的开放式读码框（ORF）,43bp的5’末端非编码区（5’URT）和172bp的3’末端非编码区（3’URT）,编码132个氨基酸残基蛋白,在氨基酸水半上与其他物种的I-FABP具有高度的同源性。以邻接法（Neigbor-Joining,NJ）所构建的系统发育关系表明,猪I-FABP与其他物种的,I-FABP属于同一类群,且与人的遗传距离最近。Northern杂交和半定量RT—PCR分析发现,猪I-FABP在猪体组织中出现约620bp大小的转录本,且在猪体组织中广泛存在,但在小肠组织中表达量最为丰富。     

人类新基因cegl cDNA的克隆及表达研究

CLECT and EGF-like domain contained Gene 1(cegl)基因是用电子克隆的方法获得的人类新基因。该基因定位在人类的第14号染色体上,是一个单一外显子的基因。cegl基因的cDNA长度为2050bp,通过生物信息学方法预测它包含一个1340bp的完整阅读框架,编码一个490个氨基酸的蛋白,含有CLECT、EGF-like结构域各一个。以cegl基因全长编码区为探针的整体原位杂交结果显示该基因的小鼠和鸡的同源基因在各自早期胚胎头部中特异表达,并且在不同时期胚胎神经系统增殖迅速的部位中有大量的表达。RT-PCR结果显示该同源基因在小鼠成体各组织中广泛分布。这提示cegl基因可能与头部生长发育有密切关系,并且对维持成体各组织的正常功能起到重要的作用。对cegl基因在胚胎发育的时间和空间表达模式的研究将有助于进一步深入地揭示它在人脑的正常生长发育中的作用。     

NOBOX homeobox mutation causes premature ovarian failure

NOBOX (newborn ovary homeobox gene) is an oocyte-specific homeobox gene that plays a critical role in early folliculogenesis and represents a candidate gene for nonsyndromic ovarian failure. We investigated whether mutations in the NOBOX gene cause premature ovarian failure (POF). We sequenced the NOBOX gene in 96 white women with POF and discovered seven known single-nucleotide polymorphisms and four novel variations, two of which, p.Arg355His and p.Arg360Gln, cause missense mutations in the homeobox domain. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) confirmed that the missense mutation, p.Arg355His, disrupted NOBOX homeodomain binding to NOBOX DNA-binding element (NBE) and had a dominant negative effect on the binding of wild-type NOBOX to DNA. Our findings demonstrate that NOBOX mutations can cause POF.     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

rHox: A homeobox gene expressed in osteoblastic cells

Homeodomain proteins are characterized by a conserved domain with a helix-turn-helix motif. These proteins act as regulatory factors in tissue differentiation and proliferation. However, their role in the regulation of osteoblast differentiation is unknown. In this study we have identified and characterized a homeobox gene in osteoblast-like cells. This gene, termed rHox, was isolated from a cDNA library derived from rat osteoblast-like cells. The nucleotide sequence of the 1,375 base pair (bp) cDNA contains a noncoding leader sequence of 329 bp, a 735 bp open reading frame, and 312 bp of 3′ noncoding sequence. Sequence comparison demonstrates that rHox is identical to the mouse Pmx gene (also called MHox) at the amino acid level and 90% homologous at the nucleotide level. Both Southwestern blotting and gel shift analyses indicate that rHox has potential to bind both the collagen l α 1 and the osteocalcin promoters. Transfection experiments using an rHox expression vector showed a strong repression of target promoter activity, regardless of whether the target promoters contained homeodomain binding reponse elements. These data suggest that rHox is a potent negative regulator of gene expression, although the specific role of rHox in bone gene regulation remains to be determined. © 1995 Wiley-Liss, Inc.     

Quox-1基因同源序列在小鼠精子发生中的表达

Ｑｕｏｘ－１基因是从鹌鹑中分离得到的Ａｎｔｐ类型的一个同源异形盒基因。以＾３２Ｐ标记的Ｑｕｏｘ－１基因的ｃ３片段为探针,采用分子杂交技术确定了小鼠基因组中存在Ｑｕｏｘ－１基因同源序列。以抗ＱＵＯＸ－１蛋白的特异性抗体对幼年小鼠睾丸、成年小鼠睾丸及附睾的蛋白质样品和组织切片,分别进行了Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析和免疫组织化学反应。结果证明,性成熟小鼠在精子发生过程中的精子形成阶段有类ＱＵＯＸ－１蛋