SAR与植物转基因沉默的消除

随着转基因技术在各个应用领域的深入和发展,转基因沉默现象已引起越来越多的人关注。转基因沉默主要发生在转录或转录后水平,涉及核酸的三种相互作用,即：ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ。这是植物基因表达调控的具体表现之一,也是外源基因插入后生物体的一种自我保护。ＳＡＲ协同转基因进行转化,可以消弱宿主ＤＮＡ对外源基因的不利影响。实验证明,在稳定整合的转基因植物中,ＳＡＲ提高了整体表达水平,并降低了不同转化体之间的差异。这是消除植物转基因沉默的一条有效途径。     

基因沉默：获得性免疫的新途径

基因沉默 (ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)首先发现于转基因植物。发生沉默的基因可以是外源性转移基因 ,也可以是入侵的病毒或宿主内源性基因。双链ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)作为启动因素或中间体为不同生物基因沉默所共有。通常 ,基因沉默发生在两种水平上 ,一是由于ＤＮＡ甲基化、异染色质化及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默 (ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉ ｌｅｎｃｉｎｇ ,ＴＧＳ) ,另一种是在基因转录后水平上通过对目标ＲＮＡ特异性降解而使基因失活的转录后基因沉默 (ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅ…     

转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用

自在转基因植物中发现转基因沉默现象以来,很多学者对该现象进行了广泛的研究,认为其作用机制有三种：位置依赖性基因沉默、转录水平基因沉默、转录后水平基因沉默。目前主要集中于转录后水平基因沉默的研究,通过研究发现它具有广泛性、可传导性及特异性的特点,并对其机制提出了一些假说。最近,人们还发现转录后水平基因沉默与植物抗病毒能力有联系。本文对转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用方面的进展作了综述。     

转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用

自在转基因植物中发现转基因沉默现象以来 ,很多学者对该现象进行了广泛的研究 ,认为其作用机制有三种 :位置依赖性基因沉默、转录水平基因沉默、转录后水平基因沉默。目前主要集中于转录后水平基因沉默的研究 ,通过研究发现它具有广泛性、可传导性及特异性的特点 ,并对其机制提出了一些假说。最近 ,人们还发现转录后水平基因沉默与植物抗病毒能力有联系。本文对转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用方面的进展作了综述     

植物转基因沉默及控制

植物基因工程的目的就是获取外源基因能够按照设计要求正常表达和稳定遗传的转基因植物。近几年来,广泛报道了转基因植物中存在转基因沉默现象。主要阐述了两种转基因沉默的机理即转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默,各种机理都涉及DNA DNA,DNA RNA,RNA RNA的相互作用。同时,还讨论一些控制转基因沉默现象的策略,特别是MAR在转基因植物中具有增强基因表达和减少株间差异的作用。     

植物转基因沉默研究进展

随着转基因技术在植物中的广泛应用,转基因沉默受到越来越多的重视。转基因沉默可发生在转录和转录后两种水平,其基本特征就是依赖于同源的重复序列。转基因的重复拷贝间,转基因与同源的同源基因间及RNA病毒与同源转基因间都会发生基因沉默。可能有不同的机制导致转基因沉默。本文综述了转基因沉默的机理研究及转基因沉默在植物抗病基因工程和植物功能基因组方面的应用。     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

双抗（抗病毒及抗虫）植物表达载体的构建及番茄的化鉴定

将抗病毒的ＣＭＶ－ｃｐ基因和抗虫的Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因依次插入到植物表达载体ＰＥ３的ＨｉｎｄⅢ和ＫｐｎⅠ位点,通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定,然后以土壤农杆菌ＧＶ３１１－ＳＥ介导转化番茄,胭脂碱检测,染色体ＤＮＡ的点杂交及ＰＣＲ扩增证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已同时导入转化再生的番茄植株。ＲＮＡ点杂交证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已在转基因番茄植株中同时获得表达。     

人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达

为研究人ＤＡＦ基因在小鼠体内遗传与表达的规律,从质粒ｐＳＦＦＶ－ＤＡＦ分离出一段包含人ＤＡＦ基因的ＤＮＡ片段。采用受精卵显微注射法建立转人ＤＡＦ基因小鼠。提取出生小鼠的染色体ＤＮＡ,经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交相结合确定首建转基因小鼠,并经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交研究人ＤＡＦ基因在转基因小鼠体内的遗传特征,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交确定其表达情况。小鼠受精卵经基因导入后,共生出２４只小鼠,其中４只被确定为首建转基因小鼠,整合率为１５％,在首建转基因小鼠两两交配生出的Ｆ１代小鼠中分别有７０％和７５％继续携带人ＤＡＦ基因。首建转基因小鼠中有１只小鼠在ＲＮＡ水平表达了人ＤＡＦ基因。可见,人ＤＡＦ基因整合入小鼠基因组中,并能够稳定遗传及表达。     

转基因植物转录后基因沉默的克服对策

人们对植物进行遗传转化的目的是让转基因在植物基因组中能够稳定整合并在当代及其子代中能够有效、稳定的表达 ,但是由于多种因素的影响 ,转基因在植物中的表达并不很理想。自从 1 986年Ｐｅｅｒｂｏｔｔｅ报道转基因烟草中转基因发生沉默以来 ,很多学者也都发现大量的转基因植株不能正常表达[1]。经过多年的研究 ,发现导致转基因沉默的机理有多种 ,根据其作用机理和水平的不同 ,人们通常把转基因沉默分为[2 ,3]:位置依赖性基因沉默 (Ｐｏｓｔｉｏｎ -ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ,ＰＤＧＳ)、转录水平的基因沉默 (Ｔｒ…     

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒（ＰｏｔａｔｏＬｅａｆｒｏｌＶｉｒｕｓ,ＰＬＲＶ）中国分离株的基因间隔区（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ,ＩＳ）双链ｃＤＮＡ以正、反向两种方式分别构建于转化载体ｐＲＯＫ２中,通过致瘤农杆菌介导,以马铃薯叶圆片为转化材料,转化马铃薯栽培品种Ｄｅｓｉｒｅ,获得了转基因植株。卡那霉素抗性分析和ＰＣＲ检测目的基因,证明ＰＬＲＶＩＳ双链ｃＤＮＡ已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中。将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种ＰＬＲＶ,观察症状并用酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）检测转基因植株中ＰＬＲＶ含量。结果表明,表达ＰＬＲＶＩＳ正意和反意ＲＮＡ的转基因植株,接种病毒后表现无症状或症状轻微,ＰＬＲＶ平均滴度均较未转基因对照植株低。表达正意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低４３％～７２％,表达反意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低７２％～８６％,由此可见,表达ＰＬＲＶＩＳ反意ＲＮＡ的转基因马铃薯对ＰＬＲＶ抗性较强。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的ｃＤＮＡ序列,设计合成了Ａｐ５和Ａｐ３两个引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了拟南芥的ＡＢＰ基因。将该基因克隆在植物表达载体ｐ３５ＳＳＩＮ的３５Ｓ启动子必Ｎｏｓ３‘端之间,得到植物表达载体ｐ３５ＳＥ。通过农杆菌介导的方法对烟草ＳＲ１进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

转基因植物中外源基因的沉默及应对策略

随着转基因技术在作物育种领域的应用,转基因植物中外源基因表达量低的现象较为普遍。导致外源基因表达量低的主要原因是基因沉默。外源基因沉默可分为转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。如何应对基因沉默,提高外源基因的表达量,是转基因技术发展亟待解决的问题。     

植物转基因沉默研究与对策

转基因沉默已成为植物基因工程实用化的严重障碍。最近的转基因沉默研究表明,植物转基因沉默可能由多种机理造成,包括DNA甲基化、转基因发生副突变、染色体高级结构影响、染色体组型的影响以及RNA降解等。其可发生在转录水平和转录后水平。随着转基因沉默机理的深入研究和新的转基因方法的建立将有可能克服转基因的沉默问题。     

用5-Fu治疗MT/p210bcr-abl转基因小鼠的研究

以５－氟脲嘧啶（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ,５－Ｆｕ）腹腔注射治疗了１２只携有金属硫蛋白（Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,ＭＴ）启动子和增强子序列、ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ（ｐ２１０）序列及ＳＶ４０剪切和Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列的转基因慢粒白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉ－ａ,ＣＭＬ）ＭＴ／ｐ２１０ｂｃｒ－ａｂｌ小鼠,于治疗的第５ｄ及第１０ｄ从不同脏器提取总ＲＮＡ、ＤＮＡ及蛋白质,分别进行ＰＣＲ分析、ＲＴ－ＰＣＲ检测被转移基因的表达水平及免疫沉淀法分析ｐ２１０ｂｃｒ－ａｂｌ转基因产物的激酶活性．结果表明,被转移基因在脾脏和骨髓中表达水平较高,胸腺和肾脏中呈低水平表达．５－Ｆｕ活体治疗１０ｄ后,被转移基因的表达水平及其表达产物的激酶活性均被明显抑制     

中国棉铃虫P450家族的CYP6B2基因与抗药性关系

运用ＲＴ－ＰＣＲ技术从棉铃虫五龄幼虫扩增到一个６２７ｂｐ的ＤＮＡ片段,测序表明这一片段为ＣＹＰ６Ｂ２基因的功能保守区,以这一片段为探针对棉铃虫除除虫菊酯抗性（Ｒ）及敏感（Ｓ）品系的总ＲＮＡ进行点杂交。ＲＮＡ点杂交表明未经氰戊菊酯诱导的情况下Ｒ品系的ＣＹＰ６Ｂ２基因的ｍＲＮＡ水平明显高于Ｓ品系,即为转录水平的调控,而经氰戊菊酯诱导后杂交表明Ｓ品系明显０被氰戊菊酯诱导,但Ｒ品系不被诱导。由此推测,棉铃     

转基因植物中外源基因沉默机制及防止对策

系统论述了诱发转基因沉默的因素、植物转基因沉默发生水平并提出了基因沉默的防止对策,基因沉默现象是导致外源基因不能在转化植物中正常表达的重要原因。甲基化、重复序列、反式失活和共抑制是基因沉默的主要诱因。其作用水平主要有三种：位置效应、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默,避免基因间的同源性、避免重复序列的出现、消除甲基化的影响、使用MAR以及使用诱导型启动子,可以提高外源基因的表达水平,有效防止基因沉默。     

应用RT-PCR检测基因的体外转录活性

体外转录分析已广泛应用于分子生物学领域．由于体外转录所产生的ＲＮＡ的量极少,需有灵敏的方法检测生成的ＲＮＡ．本研究发展了一种基于ＲＴ－ＰＣＲ技术鉴定体外转录产物的方法．将待研究基因的启动区与任何一段已知的含转录起始位点的编码序列相连,制备成体外转录的模板．体外转录后,用ＤＮａｓｅⅠ将ＤＮＡ模板完全降解;生成的ＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ;再以ｃＤＮＡ为模板,用相应的引物进行ＰＣＲ扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测．该法灵敏度高,操作简便,无需同位素,且体外转录模板制备方便．还可结合其他技术,如Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,能获得更高的灵敏度．     

GSTs同工酶基因在乳腺癌中的扩增与基因的表达

采用ＤＮＡ和ＲＮＡ的斑点杂交分析方法,对３２例乳腺癌和相应的癌旁正常组织中ＧＳＴ－π、ＧＳＴ－α和ＧＳＴ－μ基因的ＤＮＡ扩增和ＲＮＡ转录表达情况进行研究,发现ＧＳＴ－π在乳腺癌中存在基因扩增和明显的ｍＲＮＡ表达升高,ＧＳＴ－π基因表达调控主要在转录水平进行的;ＧＳＴ－α和ＧＳＴ－μ在乳腺癌中表达水平较低,但仍可见α和μ类ＧＳＴ同工酶ｍＲＮＡ转录在肿瘤和正常组织中发生了较大的变化。结合乳腺癌中雌激素受体（ＥＲ）表达情况还发现ＧＳＴ－π表达水平与ＥＲ的表达存在负相关性。     

植物转基因沉默与病毒抗性

对植物基因沉默的机制及其在植物抗病毒基因工程中的应用作了综述.植物转基因沉默是转基因植株中普遍发生的一种现象,引起植物转基因沉默的原因是多方面的,但主要涉及转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默.植物对病毒的抗性机制在某些方面与基因沉默有相似之处.