猴/人嵌合免疫缺陷病毒应用的研究进展

猴/人类免疫缺陷病毒(SHIV)自20世纪80年代末开始构建,并被广泛应用于人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)疫苗的攻毒实验和抗HIV中和抗体的活性评价.随着研究的深入,SHIV构建涉及的HIV-1病毒亚型也越来越多,如HIV-1 B、HIV-1 C、HIV-1 E等;同时,对SHIV致病性、细胞嗜性和应用的研究也有长足的进步,促进了HIV疫苗研究,并为HIV致病性研究提供了宝贵经验.     

表达HIV多价抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫效果研究

为了构建适用于中国的HIV候选疫苗,利用痘苗病毒天坛株表达中国HIV-1主要流行毒株CN54的gagpol△和gpl40TM基因。实验结果显示,重组痘苗病毒能正确表达Gag和gpl40TM蛋白。获得的重组痘苗病毒与DNA疫苗、重组腺病毒联合免疫Balb／c小鼠,并检测不同免疫程序在小鼠中诱导的细胞和体液免疫。免疫实验表明,DNA疫苗初始免疫,重组腺病毒与重组痘苗病毒依次加强所诱导的CTL应答、T淋巴细胞增殖以及中和抗体均高于其他免疫方案。DNA疫苗与两种活载体疫苗的联合运用,在小动物模型中取得了较好的免疫效果,这将为艾滋病疫苗的研究增加新的免疫策略。     

携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗的构建及鉴定

利用细菌人工染色体技术将串联的HIV-1 gp160、gag和protease基因以及表达元件插入1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)内部反向重复序列区,以获得携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗。首先将HIV-1 gp160(B型和C型)、gag和protease基因串联克隆入pc DNA3获得重组质粒pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp,重组质粒转染293FT细胞,Western blotting检测HIV抗原表达。继而将pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp中包括HIV-1抗原基因和表达元件的表达框克隆入p KO5/BN获得重组穿梭质粒p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp,穿梭质粒电转含BAC-HSV的大肠杆菌,筛选重组菌,提取重组DNA并转染Vero细胞,挑取病毒蚀斑纯化重组病毒,Southern blotting鉴定重组病毒DNA,Western blotting检测重组病毒感染细胞中HIV抗原表达,并分析病毒的增殖特性。结果表明,Western blotting在pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp转染的293FT细胞中检测到表达的gp160和gag蛋白。p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp分别电转获得重组菌,并从重组DNA转染的Vero细胞中纯化获得重组HSV,Southern blotting检测表明重组HSV基因组发生特异性重组,重组病毒感染细胞中检测到gp120和gp41,且重组HSV保留了在哺乳动物细胞中的复制能力。本研究获得携载HIV-1 gp160、gag和protease基因的重组HSV,并保留了在哺乳动物细胞中的复制能力,可作为HIV-1复制型病毒载体疫苗。     

表达HIV-1 CRF01＿AE亚型结构基因小鼠模型的建立和鉴定

目的:构建并鉴定表达HIV-1 CRF01_AE亚型结构基因的小鼠模型。方法:使用哺乳动物密码子优化的HIV-1 CRF01_AE gp160基因,通过慢病毒包装系统构建重组慢病毒LV-GFP-AE gp160,将上述重组慢病毒感染小鼠肺上皮细胞TC-1,经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达gp160基因的TC-1细胞。采用RT-PCR、流式细胞术检测gp160基因在细胞内的表达稳定性,将稳定表达Gp160蛋白的TC-1-HIV AE gp160细胞接种小鼠,用免疫组化方法检测小鼠体内细胞团块中HIV Gp160蛋白的表达。结果:菌落PCR、酶切鉴定和测序表明重组质粒pLVX-AE gp160构建正确,RT-PCR、GFP荧光及流式细胞术结果均显示gp160基因能在细胞TC-1中稳定表达,免疫组化结果也表明小鼠体内接种的细胞可以稳定表达HIV Gp160蛋白。结论:建立了稳定表达HIV-1 CRF01_AE亚型Gp160蛋白的TC-1细胞及小鼠模型,为HIV-1 CRF01_AE亚型HIV疫苗的临床前研究提供了可靠的体外、体内免疫原性评价工具,为该疫苗的进一步开发奠定了坚实的实验基础。     

AT-2灭活HIV-1病毒及纯化回收鉴定

目的制备具备完整空间构型且纯度在90%以上的灭活HIV-1病毒,用于HIV疫苗研究。方法应用化学制剂2,2’-dithiodipyridine（aldrithiol-2;AT-2）灭活HIV-1病毒,对灭活的病毒超速离心浓缩并洗涤去除灭活用的化学制剂AT-2。采用分子筛技术去除灭活病毒中残存的杂质蛋白质。结果 250μmol/L AT-2与HIV-137℃作用1 h可以彻底灭活病毒的感染性,同时保留病毒的免疫原性。灭活的病毒纯化后检测不到AT-2的残留,检测牛血清蛋白残余量低于50 ng/mL。结论灭活的HIV-1病毒经过纯化后纯度达到95.6%,可以满足作为HIV疫苗研究的免疫刺激剂的使用要求。     

狂犬病病毒基因重组载体的构建及其在重组疫苗研究中的应用

本文概述了狂犬病病毒(RV)基因重组载体构建的基本原理、该载体的优点、将该载体用于构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)重组疫苗的方法,以及所获得的疫苗在小鼠中的免疫效果,最后讨论了对该载体系统作进一步研究的可能发展方向.     

HIV-1整合酶及其抑制剂的研究进展

HIV-1整合酶是由HIV病毒pol基因编码的分子量为32KD的蛋白质,是HIV病毒复制的必需酶之一,它催化病毒DNA整合入宿主染色体DNA。人类细胞中没有HIV 整合酶的类似物[1],理论上抑制整合酶对人体副作用很小。因此HIV-1整合酶成为继HIV-1蛋白酶,逆转录酶后治疗艾滋病的富有吸引力和合理的靶标。本文综述了HIV整合酶结构,抑制剂的研究以及以HIV-1 整和酶为靶点治疗AIDS方法的最新研究进展。     

HIV-1中和抗体和基于抗体的疫苗设计

研制一种安全有效并能广泛使用的HIV疫苗对于预防和控制HIV的流行具有重要的意义。尽管人类在HIV-1病原学和免疫学方面的认识不断取得新的进步,对于HIV-1而言,普遍认为诱导保护性中和抗体的科学障碍很难逾越。在抗击HIV-1的感染中传统的疫苗策略不能提供保护。然而,近来的研究揭示在小部分HIV-1感染病人的血清中存在的某些抗体能够中和大多数的HIV-1毒株,对这些血清抗体的深入分析有助于人们揭示抗体识别的病毒表位,这些研究表明自然产生的能够中和HIV-1的中和抗体的发现可能引导未来疫苗设计的思路。高分辨率的结构信息将揭示Env 和中和抗体(Nab)结合区原子水平的结构,这些信息能够帮助设计更好的免疫原。     

分子生物学方法在HIV-1病毒检测中的应用

人类免疫缺陷病毒（HIV）是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体。根据血清学反应和核酸序列测定将HIV分为HIV-1和HIV-2两型,本研究就HIV-1基因的分子特征、HIV基因分型分类、HIV基因分型常用的方法、HIV-1病毒载量的分子生物学检测方法等方面进行讨论。     

新型HIV-1蛋白酶抑制剂的研究进展

HIV-1蛋白酶是HIV病毒蛋白成熟过程中的关键酶,对病毒的复制有着重要的影响。HIV-1蛋白酶抑制剂是抑制HIV感染的一类重要药物,但随着HIV耐药株的不断出现以及药物本身存在着副作用和生物利用度低等缺点,寻找新型的HIV-1蛋白酶抑制剂是目前亟待解决的问题。本文对近年来HIV-1蛋白酶抑制剂的研究情况进行综述,希望为寻找新的抗艾滋病药物提供帮助。