东乡野生稻双元细菌人工染色体(BIBAC)文库的构建

双元细菌人工染色体(binarybacterialartificialchromosome,BIBAC)是能直接将大片段DNA转入植物的载体,是植物基因图位克隆和构建植物基因嵌入突变体库的重要工具。该研究以东乡野生稻为材料,构建其BIBAC文库。该文库由14592个克隆组成,平均插入片段大小为65kb,覆盖率为2倍基因组。稳定性检测结果表明,东乡野生稻基因组DNA能够在BIBAC载体中稳定存在。     

大片段克隆载体研究进展

DNA克隆技术是分子生物学研究中一项重要的技术手段。自第一个质粒载体pSC1 0 1作为克隆载体以来 ,随着分子生物学技术的发展 ,克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。尤其是人类基因组计划的实施 ,产生了YAC和BAC克隆体系。随着植物基因组计划的进行 ,又产生了既能够克隆大片段DNA又能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进行功能互补实验的载体。综述了几种常用大片段克隆载体YAC、BAC、BIBAC、PAC和TAC的特点及其应用 ,并对克隆载体的发展作了展望。     

构建丝状真菌大片段基因组文库载体DNA的制备

载体DNA的制备是构建大片段基因组文库的关键步骤之一,高质量载体DNA受到酶切、脱磷等因素的影响,以载体pBHYG为材料,优化了限制性内切酶胁HindⅢ酶切和小牛肠碱性磷酸酶(CLAP)脱磷的作用条件,并在T4连接酶作用下自连,通过胶回收纯化制备了可用于进一步构建大片段基因组文库的线性载体DNA。     

一个从顶头孢霉中筛选具有启动子功能的DNA片段的简便方法

利用大肠杆菌一酵母穿梭质粒pGBT9构建了一个真菌启动子捕获载体pCBT14,用这个捕获载体构建了含顶头孢霉的0．5～2．0kb片段的染色体DNA文库,并从中筛选到顶头孢霉的24个DNA片段,这些片段能够在啤酒酵母中启动Trp1基因的表达。     

基因组细菌人工染色体文库(BAC)的构建及应用

细菌人工染色体 (BAC)是一种承载DNA大片段的克隆载体系统 ,用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点。BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组学研究的重要基础 ,可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析。本文主要综述了细菌人工染色体的构建与其鉴定 ,及其在物理图谱构建、图位克隆、转基因技术等研究上的应用。     

山羊瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析

从山羊瘤胃液中提取混合微生物DNA,经BamHI部分酶切得到50kb～800kb的DNA片段后,将其连接到pCCIBAC载体上,转化E．coliEPI300,建立山羊瘤胃微生物BAC文库。经RFLP鉴定分析,该文库12672个克隆,平均插入片段为6lkb。该文库的构建为后续新型基因的筛选提供了材料,为进一步研究山羊瘤胃微生物奠定了基础。     

小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系可转化人工染色体(TAC)文库的构建

可转化人工染色体(Transformation\|competent Artificial Chromosome,TAC)是具有克隆和转移大片段基因能力的新型载体,是植物基因克隆和转化的有效工具。为了克隆小麦抗白粉病基因和其它基因,本研究用TAC载体pYLTAC17构建了带有抗白粉病基因Pm21的小麦簇毛麦6VS/6AL易位系的基因组DNA文库。该文库包含210万个克隆,平均插入片段35kb,库容相当于普通小麦基因组的49倍。本文库以约1000个克隆组成1个混合池的方式保存在22块96孔平板,可用PCR方法进行文库的筛选。     

通过花粉管途径建立泡桐转化系统的初探

在木本科植物的遗传转化中,迄今所见到的报道全是将某一特定克隆基因导人木本植物．我们利用植物粘粒载体克隆了欧洲黑杨30kb左右的DNA片段,并利用其中的一个克隆片段,通过花粉管途径进行了导人泡桐的研究．泡桐转化植株经DNA分子杂交实验及NPTⅡ酶活性侧定证实外源DNA片段已经转移到泡桐细胞中,NPTⅡ基因得到了表达,获得了转基因泡桐植株．     

水稻cDNA文库的构建以及100种随机挑取克隆部分结构的分析

以水稻 (Oryza sativa)“广陆矮 4号”黄化苗为材料 ,用 λZAP 为载体构建了 c DNA文库。对随机挑取的 1 0 0个 c DNA进行部分顺序测定后 ,与水稻和其它植物已知的基因结构作同源性比较分析 ,表明1 3%的 c DNA克隆可以确定功能 ,1 2 %的 c DNA克隆与其它植物中未知功能的基因片段有同源性 ,其余75%的克隆则表现出极少相似性或无任何同源性 ,从中可能发现新的基因。结果表明这个 c DNA文库适宜于进行大量顺序分析。由此将会获得更多功能性基因的信息。     

香菇顺式调控元件的克隆及其序列分析

应用顺式调控元件探测载体G221构建了一个香茹Lentinula edodes基因组文库。G221为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体,含有一个由酵母Cycl基因基本启动子控制的lacZ标记基因,能以转录增强活性筛选香茹DNA片段。用这个基因组文库转化酵母菌,获得了一批lacZ阳性转化子。对其中表达较强的阳性转化子进行质粒抽提和双酶切鉴定,筛选到50个香茹顺式调控元件DNA片段。对其中部分片段进行了测序,并对其中一个序列进行了序列分析,鉴别了该序列上的几个与转录相关的特征序列。该研究也探讨了利用酵母表达系统克隆香茹顺式调控元件的可行性。     

以可转化人工染色体(TAC)载体为基础的百脉根基因组文库的构建及筛选

可转化人工染色体(transformation-competentartificial chromosome,TAC)载体是具有克隆和转移大片段DNA特征的新型载体,是植物基因克隆和转化的有效工具.该研究把它用于豆科植物百脉根(Lotus japonicus)基因组文库的构建.此文库由1.8×105个克隆组成,平均插入片段大小为15kb左右,约覆盖百脉根基因组6倍.文库保存在12块96孔板中,每个孔中约含150个不同的重组克隆.用与花发育相关的同源基因Ljcen1片段为探针,筛选得到6个阳性克隆,酶切后验证这些阳性克隆,结果表明这些克隆含有同一个基因片段.此基因组文库可直接用于植物转化,为百脉根功能基因组的研究打下基础.     

A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA

A binary-BAC (BIBAC) vector suitable for Agrobacterium-mediated plant transformation with high-molecular-weight DNA was constructed. A BIBAC vector is based on the bacterial artificial chromosome (BAC) library vector and is also a binary vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. The BIBAC vector has the minimal origin region of the Escherichia coli F plasmid and the minimal origin of replication of the Agrobacterium rhizogenes Ri plasmid, and thus replicates as a single-copy plasmid in both E. coli and in A. tumefaciens. The T-DNA of the BIBAC vector can be transferred into the plant nuclear genome. As examples, a 30-kb yeast genomic DNA fragment and a 150-kb human genomic DNA fragment were inserted into the BIBAC vector; these constructs were maintained in both E. coli and A. tumefaciens. In order to increase the efficiency of transfer of unusually large BIBAC T-DNAs, helper plasmids that carry additional copies of A. tumefaciens virulence genes virG and virE were constructed. These helper plasmids are compatible with, and can be present in addition to, the BIBAC vector in the A. tumefaciens host. This report details the components of the BIBAC system, providing information essential to the general understanding and the application of this new technology.     

细菌人工染色体文库的构建及应用

细菌人工染色体（BAC）是第二代大片段DNA的克隆载体系统,具有容量大、嵌合率低、遗传特性稳定、转化效率高、插入片段易回收、操作简便等优点,因而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究中,并发挥着前所未有的重要作用。本文综述了BAC的发展,利用此载体构建基因组文库的程序和鉴定方法,及其在物理图谱构建、图位克隆、基因组测序、转基因技术等研究中的应用。     

酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2.375菌株的DNA为模板,根据已发表的序列设计引物,经PCR扩增得到约900 bp的HAL1基因片段,连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌JM109,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定,结果显示已克隆到完整的可读框,该基因的序列与已知序列同源性达99%。将HAL1基因从T-载体上切下连接到pAM194载体上构建了HAL 1基因的植物表达载体,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。     

荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析

采用包埋法提取荷斯坦奶牛瘤胃微生物大片段总DNA,纯化后脉冲场电泳回收大小为36～48 kb,与pcc2FOS vector连接,转染至大肠埃希菌EPI 300宿主细胞,构建瘤胃微生物Fosmid基因组文库.对文库进行鉴定,该文库平均插入片段大小约35 kb,共保存30 000个克隆,空载体率小于2%,库容达1 050 Mb.     

几种新型植物基因表达载体的构建方法

利用基因工程技术手段研究基因功能过程中,构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位,采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway技术、三段T-DNA法、一步克隆法等,还有近年来出现的几种新型的载体构建方法:基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体;MicroRNA前体PCR置换法适用于构建小分子RNA表达载体;重组融合PCR法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建;利用In-Fusion试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域;构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning,SLIC)法;Gibson等温拼接法;Golden Gate拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上,结合自己工作的体会和经验分析这7种新方法的特点,期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。     

水稻重复序列RRD3:植物启动子及其在RNA干涉中的应用

RRD3是通过复性动力学从水稻基因组中克隆到的一个中度重复序列,序列分析揭示其含有多个保守的启动子元件,包括4个TATA-boxes和CAAT-box,在Escherichia coli及哺乳动物表达系统中均表现出启动子活性。我们将RRD3片段插入到植物启动子捕获载体pCAMBIA1391Z中,检测RRD3片段是否在植物中也有启动子活性,转基因烟草再生植株和水稻愈伤组织均显示了gusA基因的表达,表明其在单子叶和双子叶植物中均可行使启动子功能。基于RRD3的双效启动子特性,我们设计并构建了植物通用双元RNAi载体pCRiRRD3,适于进行植物的RNA干涉实验研究。我们在植物RNAi载体pCRiRRD3的内含子(200bp)的上下游分别引入了2个多克隆位点,方便了正义及反义片段的接入。转基因烟草植株的GUS组织化学及荧光定量分析表明该载体可有效进行RNA沉默。这些研究结果表明,利用单子叶和双子叶双效活性的RRD3启动子而构建的植物RNAi载体,可同时有效地应用于大部分单子叶和双子叶植物的RNAi实验及研究。     

Construction of a Plant Transformation-ready Expression cDNA Library for Thellungiella halophila Using Recombination Cloning

Salt cress （Thellungiella halophila）, a close relative of the model plant Arabidopsis thaliana L., is an extremophile that is adapted to harsh saline environments. To mine salt-tolerance genes from this species, we constructed an entry cDNA library from the salt cress plant treated with salt-stress by using a modified cDNA synthesis and an improved recombinationassisted cDNA library construction method that is completely free of manipulations involving restriction enzymes and DNA ligase. This cDNA library construction procedure is significantly simplified and the quality of the cDNA library is improved. This entry cDNA library was subsequently shuttled into the destination binary vector pCB406 designed for plant transformation and expression via recombination-assisted cloning. The library is plant transformation ready and is used to transform Arabidopsis on a large scale in order to create a large collection of transgenic lines for functional gene mining.