棉铃虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

以棉铃虫Helicoverpa armigera蛹为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-200分子筛柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰- β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂。纯酶的比活力为2 678.79 U/mg。以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学。结果表明：酶的最适pH为5.63,最适温度为55℃。该酶在pH 4～8区域较稳定,而在pH>8时能迅速失去活力;在50℃以下处理30 min,酶活力仍保持稳定,高于50℃,酶很快失去活力。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.16 mmol/L,最大反应速度Vm为10.73 μmol·L^-1·min^-1。酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为66.24 kJ/mol。     

意大利蜜蜂N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质分析

【目标】N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖糖苷酶(NAGase)是一种重要的几丁质分解酶,能从N-乙酰葡萄糖苷的非还原端催化去除β-1,4-N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基,参与了昆虫外骨骼的蜕皮过程。研究蜜蜂该酶的特征有助于阐明其在蜜蜂发育过程中的作用机制。【方法】采用40%-70%硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析和葡聚糖G-100凝胶过滤层析的方法从意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫体内分离纯化NAGase。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物检测该酶的活力,用native PAGE和SDS-PAGE检测酶的纯度。IEF-PAGE测定该酶等电点。葡聚糖G-200凝胶过滤层析测定酶的总分子量。【结果】结果显示,纯化的NAGase酶的比活力为803. 09 U/mg,总分子量为77. 3 kD。结合SDS-PAGE表明该酶由两个具有相同分子量(39 k D)的亚基组成。该酶等电点为4. 8。酶水解底物pNP-NAG的过程遵循米氏方程,米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)分别为0. 11 mmol/L和17. 65μmol/L·min。该酶水解反应的最适pH和最适温度分别为pH 5. 5和60℃。酶催化pNP-NAG反应的活化能为64. 8 k J/mol。Pb2+,Cu2+,Zn2+和Al3+对该酶有不同程度的抑制作用。【结论】本研究描述了意大利蜜蜂NAGase的分离纯化方法及其理化性质,为进一步进行蜜蜂NAGase的结构解析和功能研究奠定基础。     

日本鳗鲡肠道N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨日本鳗鲡(Anguilla japonica)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52, NAGase)的分离纯化及其酶学性质, 通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-100分子筛凝胶柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化NAGase, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE鉴定酶的纯度、测定酶蛋白亚基分子质量; 以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物, 研究NAGase催化反应的动力学参数, 探讨其酶学性质。结果表明: 日本鳗鲡肠道NAGase纯酶制剂比活力为2517.40 U/mg, 酶蛋白亚基分子质量为69.98 kD, 酶的最适pH、最适温度、米氏常数K_m和最大反应速度V_max分别为6.0、60℃、0.336 mmol/L和7.634 μmol/(L·min); 酶在pH 4.8—7.2较稳定, 在温度60℃以下具有较好的热稳定性, 在65℃以上酶迅速失活。Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+和Fe3+对NAGase表现出不同程度的激活作用, Na+、Li+和Ba2+对酶活力几乎没有影响, Zn2+、Fe2+、Pb2+和Hg2+对酶活力有不同程度的抑制作用, Hg2+对酶活力抑制作用最强, 1.0 μmol/L Hg2+可使酶活力丧失83.69%。化学修饰法研究表明, 精氨酸胍基不是日本鳗鲡NAGase的必需基团, 而赖氨酸?-氨基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基、丝氨酸羟基和色氨酸吲哚基是酶的必需基团, 二硫键是NAGase活性所必需的。综上所述, 实验采用的日本鳗鲡肠道NAGase分离纯化方案有效可行, 酶活力易受环境中酸碱度、温度和金属离子的影响, 且与其他不同动物来源的NAGase具有相似的必需基团。     

凝结芽孢杆菌耐热β­N­乙酰氨基葡萄糖苷酶在大肠杆菌的分泌表达及其在制备GlcNAc中的应用

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶体,可作用于几丁质或壳聚糖等天然底物,从末端水解产生N-乙酰-β-D氨基葡萄糖 (GlcNAc) 单体,其在医药和农业领域有较广泛的用途。文中克隆了耐热菌凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans DMS1的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因 (BcNagZ),并成功在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 进行了分泌表达,蛋白表达量达到0.76 mg/mL。纯化后的BcNagZ分子量为61.3 kDa,测得的比活力为5.918 U/mg;进一步对该酶进行表征,结果显示酶的最适反应pH为5.5,最适反应温度为75 ℃,在65 ℃处理30 min后还有85%的残余酶活力,表明该酶具有良好的热稳定性。该酶的米氏常数Km为0.23 mmol/L,Vmax为0.043 1 mmol/(L·min)。重组BcNagZ可以水解胶体几丁质得到微量的GlcNAc,可以将二糖水解为单糖;偶联已报道的外切几丁质酶AMcase,可以有效地将胶体几丁质水解为GlcNAc,得率达到86.93%。     

苜蓿链霉菌内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的克隆、表达及酶学性质

内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶广泛应用于糖生物学研究和工业生产。本研究从苜蓿链霉菌Streptomyces alfalfae ACCC 40021中克隆并原核表达了一个新的内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,该酶最适反应温度为35℃,最适pH为6.0,具有良好的pH稳定性、温度稳定性和高比活(1×10~6 U/mg)的特性,可催化不同蛋白底物去糖基化,具有作为工具酶和生物催化剂的潜力。     

日本根霉IFO5318胞外β—葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe~(3 )、Hg~2 )等对酶活力有抑制作用。     

Solitalea canadensis源β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因克隆、异源表达和酶学特性

【目的】对细菌Solitalea canadensis中编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因进行克隆,通过原核表达获得重组β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并研究其酶学性质。【方法】以Solitalea canadensis基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖(pNP-β-Glc NAc)为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适p H以及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Solitalea canadensis克隆得到了β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因片段(Gene Bank:WP_014682183.1),全长2586 bp,重组表达所得蛋白表观分子量约为97 k Da,最适pH 6.0,最适温度42°C,但不稳定,半衰期小于5 min。该酶对十二烷基磺酸钠(SDS)敏感,活性受Triton X-100和尿素的抑制。此外二糖分子也能不同程度地抑制该重组酶的活性,特异性抑制剂PugNAc(O-(2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylideneamino)N-phenylcarbamate)对该酶的IC_(50)为2μmol/L。该重组酶蛋白除能水解对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-乙酰氨基半乳糖(pNP-β-GalNAc)外,还能对O-链聚糖核心结构Core Ⅱ末端的乙酰氨基葡萄糖进行水解。【结论】本文首次从Solitalea canadensis中克隆得到能水解末端β1-6连接的乙酰氨基葡萄糖而不能水解β1-4连接键的β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并对其进行了酶学性质研究和底物特异性分析,为开发高效特异性强的糖链分析工具酶提供理论基础。     

3-氰基吡啶水合酶的纯化及性质

马红球菌(Rhodococcus equi)SHB-121胞内3-氰基吡啶水合酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-cellulose DE52和羟基磷灰石柱层析并经过Sephadex G-25处理,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的3-氰基吡啶水合酶,纯化了31倍。该酶由一条肽链组成,其分子量为30kD,等电点为4.1。3-氰基吡啶水合酶能催化3-氰基吡啶水合生成尼克酰胺。酶反应最适pH为8.0,最适温度为30℃。Ag~+、Hg~(2+)、Cu~(2+)及NH_4~+对酶活力有强烈抑制作用。当以3-氰基吡啶为底物时,其K_m为0.1mol/L。NaCN为该酶反竞争性抑制剂,其K_I为5mmol/L。     

醋酸酐对太平洋白对虾(Penaeus vannamei)β-N-乙酰- D-氨基葡萄糖苷酶的抑制动力学

β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶与南美白对虾的食物消化吸收、蜕壳生长有着密切关系. 海水里存在的有机污染物将影响酶生理功能, 从而进一步影响虾的正常蜕壳,严重将导致对虾的死亡. 醋酸酐是常用的有机溶剂, 故本文应用动力学方法研究醋酸酐对南美白对虾β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶催化pNP-NAG水解时酶活力的变化规律. 表明在醋酸酐浓度低于20.0 mmol/L, 酶的抑制作用是可逆的, 测得醋酸酐对酶抑制的IC50为9.0 mmol/L. 用双倒数作图法测定醋酸酐与游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)的结合平衡常数, 结果显示醋酸酐是酶的非竞争性抑制剂. 用底物反应动力学方法观测在不同底物浓度下酶在0.0、3.0、6.0、9.0、12.0 mmol/L的醋酸酐溶液中的失活过程,分别测定了酶的微观失活速度常数k+0及复活速度常数k-0, 结果表明醋酸酐对酶的影响是快速结合再缓慢失活的过程. 比较微观失活速度常数k+0及复活速度常数k-0, 结果暗示在高浓度的醋酸酐溶液中, 酶将完全失活.     

新型海洋微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及重组酶性质

通过功能筛选方法,从中国南海海洋表层海水微生物元基因组文库筛选得到了6个β-葡萄糖苷酶阳性克隆。对其中的一个阳性克隆pSB47B2进一步亚克隆和序列分析,获得一新型β-葡萄糖苷酶基因(命名为bgl1B)开放阅读框。以pET22b(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,bgl1B被高效活性重组表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了重组Bgl1B(rBgl1B)。纯化的rBgl1B催化pNPG水解反应的最适pH为6.5,最适温度为40oC。在最适反应条件下,rBgl1B水解pNPG的活性达到39.7U/mg,Km和Vmax分别为0.288mmol/L、36.9μmol/min。纤维二糖是rBgl1B的有效作用底物,其Km和Vmax分别为0.173mmol/L、35μmol/min。但rBgl1B不能催化转化蔗糖、乳糖、麦芽糖以及CMC。rBgl1B催化pNPG的水解反应对高浓度的Na+有较好的耐受性,而低浓度的Ca2+、Mn2+对该酶活有一定促进作用。不同于许多来源于真菌的酸性β-葡萄糖苷酶,rBgl1B在pH7.0～9.0范围内具有比较高的酶活力并具有较好的稳定性。     

一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株,确定该菌分类地位,并对其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。【方法】采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)显色法进行复筛;通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列相似性分析等方法确定其分类学地位;利用超滤、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析法对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化;以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度,通过双倒数作图法确定β-葡萄糖苷酶催化不同底物水解的米氏常数Km值。【结果】从土壤样品中筛选得到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株ZF-6C,初步鉴定为Bacillus korlensis;芽胞杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶的分子量约为90 kD,最适反应pH和温度分别为7.0和40°C,该酶具有水解β(1,4)糖苷键的活性,最适底物为邻硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,Km值为0.73 mmol/L。金属离子Ca2+、Pb2+增强酶活,而Cu2+、Fe2+抑制酶活。【结论】首次报道从Bacillus korlensis中分离得到β-葡萄糖苷酶,Bacillus korlensis ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶在分子量、最适反应条件及底物特异性等方面均不同于已知酶,可能为一结构新颖且催化效率较高的β-葡萄糖苷酶。     

β-脱卤酶的基因克隆表达及其酶学性质

根据GenBank中的序列设计引物,克隆芽孢杆菌中的β-脱卤酶基因(命名为bhd)。以pET30a(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)-CondonPlus为宿主菌,实现了bhd的高效表达。使用HisTrapTMFF亲和层析柱纯化重组β-脱卤酶,分子量约为23.1 kD。酶学性质研究表明,纯化的重组β-脱卤酶水解3-氯丙酸制备3-羟基丙酸的最适反应体系为30°C,100 mmol/L,pH 7.0的磷酸钠缓冲液。在最适反应条件下,重组β-脱卤酶的比活为16.2 U/mg,Km和Vmax分别为3.26μmol/L和17.86 mmol/(min.g protein)。在最适反应条件下,以10 mmol/L 3-氯丙酸为底物,反应36 h的转化率在93%以上。     

溜曲霉β-N-乙酰氨基己糖苷酶的催化特性

已纯化的溜曲霉β-N-乙酰氨基己糖苷酶(表现出β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β—N-乙酰氨基半乳糖苷酶活力)水解对硝基酚-N-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基酚-N-乙酰氨基半乳糖苷,其Km值分别为0．44和2．0mol／L。 Vmax值分别为740.0和476．5μmol·min-1·mg-1。氨基葡萄糖、氨基半乳糖、GlcNAc及GalNAc均为这两个酶的竞争性抑制剂,对β-GlcNAca se的KI值分别为34．9、62．5、1 6．9及38．2mmol／L,而对β-GalNAcase的K1值分别为24.1、7 5．0、50．0及1 31．8mmol／L。将pNPGIcNAc和pNPGalNAc等量混合为底物,其酶活力小于单独以pNPGlcNAc为底物的话力,大于以pNPGalNAc为底物的活力。两种底物以不同摩尔分数混合测活结果,用Lineweaver—Burk双倒数法作图,均为直线,求出表观Vmax5 将各个vmax对摩尔分数f(从f=0至f=1)作图,没有出现最大值。由抑制作用及混合底物竞争动力学说明β-GlcNAca se和β-GalNAcase同存在于一个蛋白质,并共用一个活力部位。     

白蚁肠道元基因组来源高温β-葡萄糖苷酶Bgl17的酶学性质

【目的】对短角球白蚁(Globitermes brachycerastes)肠道元基因组文库中筛选得到的一个新型β-葡萄糖苷酶编码基因bgl17进行酶学性质研究。【方法】通过克隆与异源表达得到纯的Bgl17酶蛋白,根据Bgl17对底物的水解活性测定其稳定性及动力学参数,利用薄层层析确定其水解产物。【结果】该酶属于糖基水解酶第一家族(GHF1),对其特异性底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPGlc)的最适反应温度为70 °C,最适pH为5.0。在最适反应条件下,该酶以pNPGlc为底物比活力为115.69 U/mg,以水杨苷为底物比活力为297.39 U/mg。以pNPGlc为底物时,其动力学参数Km值和Vmax分别为0.81 mmol/L和227.27 μmol/(mL·min)。在稳定性方面,该酶在50 °C处理1 h仍可保持50%的活性,在pH 5.0和6.0条件下,该酶的半衰期为1 h。【结论】该酶在较高的温度下具有较高的活性,且对水杨苷水解活性高,这点不同于已知的β-葡萄糖苷酶,推测其更有利于木质纤维素复杂结构的降解;该酶的最适温度远高于白蚁生存环境温度,可为研究白蚁降解纤维素的机理提供参考。     

2,5-DKG还原酶I的分离纯化与性质研究

欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)还原酶I基因,5 L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶I,纯化了5倍,得率27%,比活力为3,418 U/mg。测定了该酶的一些特性参数:分子量为34 kD,等电点为6.0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙酸(2-KLG),对NADPH和2,5-DKG底物的Km值分别是0.29mmol/L和14.7 mmol/L,1 mmol/L Cu2 、Zn2 等有强烈抑制作用,EDTA和巯基乙醇对该酶没有抑制作用,酶的最适pH为7.0,最适反应温度为40℃。     

变色栓菌锰过氧化物酶同工酶的纯化及其性质研究

变色栓菌(Trametes versicolor)胞外产酶培养液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析后,获得两个活性组分D1和D2,其中活性组分D2经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析后,所得样品MnP1经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。活性组分D1经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析后,所得样品MnP2经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。两种同工酶MnP1及MnP2,各自的比活力为579.09、425.00U/mg;纯化倍数为17.51、12.85;活力回收率为6.17%、2.47%。由SDS-PAGE法测得MnP1及MnP2的表观分子量分别为46.3kD、43.0kD。两种同工酶催化DMP(2,6-二甲氧基酚)氧化反应的最适pH值及最适反应温度有所不同,最适pH值分别为pH5.8、pH6.2,最适反应温度分别为60℃、65℃。在45℃以下,pH4.0~7.0之间,MnP1及MnP2的稳定性好。DMP为最佳酶促反应底物,以DMP为底物的Km分别为13.43μmol/L、12.45μmol/L。在无Mn2 存在的条件下,酶促反应几乎不发生。EDTA在较高浓度时抑制酶的活性,DTT在所试浓度下都完全抑制酶的活性。     

太平洋白对虾(Penaeus vannamei)β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶液中的失活动力学(英文)

应用动力学方法研究了太平洋白对虾(Penaeusvannamei)β-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶液中以pNP-β-D-GlcNAc为底物时酶活力的变化规律.表明酶在DMSO浓度低于4.20mol/L,酶的失活过程是可逆的,DMSO并不造成酶绝对量的减少,仅对酶的活力发生可逆的下降.测得DMSO对酶抑制的IC50为1.2mol/L.观测了在不同底物浓度下NAGase在0、0.35、0.70、1.05、1.40、1.75mol/L的DMSO溶液中的失活过程,分别测定了游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)的微观失活速度常数k+0和k′+0比较结果(k+0值远远大于k′+0)表明,在DMSO溶液中游离酶比酶-底物络合物更易失活,即底物的存在对于酶被DMSO的失活具有明显的保护作用.随着DMSO浓度的增加,游离酶的逆向微观复活速度常数k-0却不断降低,说明在高浓度DMSO环境中,NAGase可逆恢复的能力逐渐微弱.     

2,5-DKG还原酶Ⅰ的分离纯化与性质研究

欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（2,5-DKG）还原酶Ⅰ基因,5L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE—Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶Ⅰ,纯化了5倍,得率27％,比活力为3,418U／mg。测定了该酶的一些特性参数：分子量为34kD,等电点为6．0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）,对NADPH和2,5-DKG底物的Km值分别是0．29mmol／L和14．7mmol／L,1mmol／L Cu^2＋、Zn^2＋等有强烈抑制作用,EDTA和巯基乙醇对该酶没有抑制作用,酶的最适pH为7．0,最适反应温度为40℃。     

一种来源于兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作用于肽聚糖或几丁质,从其非还原末端水解产生β-D-N-乙酰氨基葡萄糖单体,该酶在细胞壁代谢过程中起重要作用,在医药和生物技术领域也有广泛的应用。【目的】克隆表达来源于兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703,为获得乙酰氨基葡萄糖单体奠定基础。【方法】以B.pseudofirmus703基因组DNA为模板,克隆得到了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因NagZ703,通过构建pET28a-nagZ703表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达NagZ703,利用镍柱纯化得到NagZ703纯蛋白,并对其酶学和生化性质进行分析。【结果】NagZ703与其同源蛋白多序列比对分析结果表明,NagZ703属于糖苷水解酶3家族(GH3),由2个结构域构成,催化活性中心由位于N端结构域的Arg232-His234-Arg318组成,和研究最多的Bacillussubtilis168来源的BsNagZ氨基酸的序列相似性为37%。酶学性质分析表明,以对硝基酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-β-GlcNAc)为底物,NagZ703的最适反应温度和pH分别为60°C和pH 6.5,比酶活为10.79 U/mg,其Km和Vmax分别为0.276 mmol/L和0.612 mmol/(mg·min)。该酶具有较好的稳定性,在50°C处理30 min,或在pH 6.0–10.5条件下,4°C保存12 h后,仍保留80%以上的酶活力。EDTA不影响该酶的活性,推测其为非金属依赖酶,且Hg2+可完全抑制酶活性。【结论】本研究将兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703来源的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703在大肠杆菌中成功表达和纯化,并分析了其酶学性质;NagZ703的最适pH为6.5,没有表现出耐盐嗜碱的特征;NagZ703能水解胶体几丁质产生GlcNAc,为酶解生产GlcNAc提供了一条可行的思路。     

棘孢曲霉SM-L22β-葡萄糖苷酶的纯化与性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。