用AFLP技术检测慢生型花生根瘤菌竞争结瘤的研究

以 5株慢生型花生根瘤菌和天府 3号花生为材料 ,用 AFLP技术研究了慢生型花生根瘤菌 Spr2 - 9、Spr3- 3、Spr3- 5、Spr4- 5和 Spr7- 1的遗传特性和竞争结瘤能力。结果显示 ,供试条件下 ,传代次数对菌株的遗传性状无明显影响 ,2 8℃培养条件下 ,花生根瘤菌连续传 96代 ,其 AFLP指纹未发生明显变化 ;37℃培养 ,仅 Spr3- 3和 Spr3- 5能够存活并正常生长 ,其 AFLP指纹也未发生明显改变 ,然而其它菌株不能生长。将供试慢生型花生根瘤菌分别接种天府 3号花生 ,光照培养 30 d后 ,随机各取 4个根瘤 ,从根瘤中提取类菌体 DNA进行 AFLP分析 ,各根瘤类菌体 DNA的 AFLP指纹图谱与该菌株纯培养物 AFLP指纹相同。将 5个菌株混合接种天府 3号花生 ,不同菌株的占瘤率存在差异 ,Spr3- 3和 Spr3- 5的竞争结瘤能力最强 ,两菌株的占瘤率之和为 85.4% ;Spr4- 5的占瘤率为 1 2 .2 % ;Spr7- 1为 2 .4% ;而 Spr2 - 9的竞争结瘤能力最差。本试验结果说明 ,AFLP技术用于根瘤菌生态和竞争结瘤能力研究 ,具有下列优点 :简易、快速、准确 ;直接取豆科植物的根瘤提取 DNA,进行原位研究 ;在不改变菌株遗传特性 ,即不使用突变株的前提下 ,可以直接测定已知菌株的竞争结瘤能力     

基于非培养和培养的方法比较花生根瘤菌遗传多样性

摘要:【目的】比较非培养和培养方法揭示的花生根瘤菌遗传多样性差异,以期建立慢生根瘤菌快速检测占瘤率技术。【方法】采用经典分离培养技术获得花生根瘤菌和非培养方法直接从根瘤中收获类菌体分别提取DNA后,比较分析BOX-PCR指纹图谱,根据多样性指数评价基于非培养和培养方法的BOX-PCR指纹图谱技术揭示花生根瘤菌遗传多样性的差异。【结果】基于非培养方法检测的花生根瘤类菌体为81.8%,获得85种遗传群;基于培养方法分离花生根瘤菌菌株为72.7%,获得71种遗传群;两种方法共同检测到17种 BOX-PCR遗传图谱相一致。根据多样性指数基于非培养方法反映不同地区花生根瘤菌遗传多样性结果较一致,基于培养方法反映各地区的花生根瘤菌遗传多样性结果存在明显差异。【结论】基于非培养方法检测根瘤类菌体的遗传多样性,能够更快速、真实反映不同土壤花生根瘤中的优势遗传群,快速地统计根瘤菌菌株占瘤率;与培养方法相结合有利于获得花生根瘤菌竞争结瘤能力强的土著菌株,从而为筛选高效根瘤菌菌株奠定基础。     

光敏生物素标记总DNA探针对大豆根瘤菌的检测

以光敏生物素标记慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110总DNA作为探针,与快生型大豆根瘤菌杂交时,没有杂交斑点形成,而与慢生型大豆根瘤菌中的部分菌株能形成杂交斑点,表明该探针具有种和部分菌株特异性,用该探针与压碎的根瘤汁液进行DNA杂交,检测USDA110在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力,发现USDA110在大豆不同生育期的占瘤率为70%～90%。     

广谱型花生根瘤菌97—1菌株在花生和大豆根瘤中的分化和繁殖能力

比较了广谱型花生根瘤菌97—1菌株在花生和大豆根瘤中的形态分化和类菌体的繁殖能力。结果表明,97—1菌株在花生根瘤中分化为典型的球状类菌体,未观察到它们的繁殖,根瘤小杆菌的繁殖率也很低,并表现出随瘤龄增加而加大的趋势,渗透压保护条件对幼龄根瘤小杆菌的繁殖有一定影响。但在大豆根瘤中却分化为典型的杆状粪菌体,其繁殖能力随瘤龄加大而增加,并且不需要渗透压保护条件。本研究结果直接证明,宿主植物影响根瘤菌在根瘤中的形态分化和繁殖特性。     

应用BOX分子标记技术筛选南苜蓿高效根瘤菌菌株

【目的】应用BOX-PCR技术对12株南苜蓿(Medicago polymorpha)接种根瘤菌菌株在土壤中的竞争结瘤能力进行研究,以占瘤率的高低配合植物生长性状最终确定与南苜蓿共生的高效根瘤菌菌株。【方法】对接种根瘤菌产生的南苜蓿根瘤进行分离培养,选择部分结瘤菌株和12株全部供试接种菌株进行BOX分子指纹图谱研究,经过对图谱的比较与分析获得了各接种菌株的占瘤率。【结果】在供试菌株中,来自于云南盈江的菌株SWF67523占瘤率最高,为93.33%,说明菌株SWF67523具有较强的竞争结瘤能力,该菌株对南苜蓿干重增幅也较高,为100%;菌株SWF67409来自于云南楚雄,其占瘤率略低于菌株SWF67523,但其对提高植物干重的贡献最大(增幅106.5%);来自于云南楚雄的菌株SWF67394占瘤率较低,但其结瘤率高,对植物生长的影响作用也较明显。【结论】将根瘤菌菌株的竞争结瘤能力纳入南苜蓿高效根瘤菌菌株的筛选中,研究获得了一株竞争结瘤能力强、显著提高植物生物量的菌株SWF67523,以及促生根瘤菌菌株SWF67409和SWF67394,为生产高效根瘤菌菌剂提供了物质基础。     

应用RAPD分子标记技术研究苜蓿根瘤菌的田间竞争结瘤能力

以在温室条件筛选出与 Vector苜蓿品中匹配较好的根瘤菌系 CCBAU30 1 38和 Vector为材料 ,应用 RAPD技术研究CCBAU30 1 38田间竞争结瘤能力。结果显示 ,利用冻融法处理的根瘤、菌体提取的 DNA可以直接作为 PCR扩增的模板 ,扩增结果与以类菌体 DNA及总 DNA作为模板处理的结果相同 ;以根瘤处理物作为 PCR扩增的模板 ,应用 RAPD分子标记技术对接种菌 CCBAU30 1 38田间竞争结瘤能力进行研究 ,接种 1 4 0 d后 ,CCBAU30 1 38田间占瘤率为 4 7.7% ,表明该菌具有较强竞争结瘤能力和持久力。试验结果还说明 ,在接种菌与土著菌有差异的条件下 ,应用 RAPD技术开展竞争结瘤能力研究 ,可以直接以根瘤处理物作为 PCR扩增的模板 ,具有简易、快速、准确等优点     

紫云英根瘤菌胞外多糖缺失变种及其结瘤性状的变化

根据紫云英根瘤菌在寄主豆科植物紫云英上的结瘤能力,经转座子Tn5诱变获得的18株Exo~-变种可分为4种结瘤类群(A-D):A类变种诱导植物产生小的瘤状突起,不具固氮能力;B类变种形成无效根瘤;C类变种产生固氮效率降低的根瘤;D类变种丧失了结瘤能力。电镜分析显示:无效瘤和瘤状突起中不存在类菌体区,根瘤细胞均为不含细菌的空细胞,侵染线不能穿透到根瘤细胞中。说明紫云英根瘤菌胞外多糖很可能参与有效根瘤的形成。     

超慢生型大豆根瘤菌的生理生化和共生特性的研究

超慢生型大豆根瘤菌(ESG,extra—slow-gfowing soybean rhizobium)是不同于大豆另两类共生体——慢生型大豆根瘤菌(Bradyhizobium,japonicum)和快生型大豆根瘤菌(Sin-orhizobium fredii)的新类群。它们在生长速率和生理学特性等方面均表现出较大的差异。根瘤类菌体的扫描结果表明,ESG的类菌体形态为杆状,与另外两群相近,但发现有“Y”形类菌体。ESG利用碳源范围较窄,抗生素自然耐受性比慢生型低,在柠檬酸盐培养基上不生长;代时超长,已测定的7个菌株代时为23．3-41．9h。细胞成分N,c分析结果表明,ESG在三个类群中N含量最高,C含量最低。温室盆栽试验证明ESG中大部分菌株的固氮酶活性和植株含氮量与生产用菌株相当。ESG菌株可以在绿豆上结瘤并有固氮酶活性。     

磁场对大豆共生固氮的效应

恒定磁场处理慢生大豆根瘤菌“005”和接种后的大豆植株,发现磁场可以提高根瘤的固氮活性。在一定的磁场强度(70—100mT)下,固氮活性平均可以提高4—5倍,植株的结瘤数和根瘤重量平均提高2—3倍。从这样的根瘤中所分离出的根瘤菌,由慢生型转变成快生型,在100植株中有17株的根瘤分离出快生菌。生长世代时间和培养溶液中的pH值与慢生型不同,而与快生型相同。     

1株高效花生根瘤菌的筛选与鉴定

从辽宁多地花生种植土壤及其鲜根瘤初步筛选到30株花生根瘤菌,进一步通过回接盆栽花生,测定花生根瘤数、根瘤干重,以及鲜根瘤固氮酶活性、植株全氮量等,筛选出1株结瘤固氮能力较强花生根瘤菌wz-6,通过16S rDNA序列分析,鉴定为圆明慢生根瘤菌(Bradyrhizobium yuanmingense)。为开发优质花生根瘤菌菌剂奠定基础。     

两株大豆根瘤菌在结瘤过程中的相互影响

本文报道了大豆根瘤菌菌株PRc005和CB1809在大豆“矮脚早”品种上的竞争结瘤能力。在灯光栽培室进行了大豆砂培盆栽试验,考察了大豆根瘤数、根瘤千重和地上部植株千重。用免疫荧光抗体检测了两个菌株的占瘤率。试验结果表明,菌株cB1809的竞争结瘤能力显著地比菌株PRC005差,后者占有绝对的竞争结瘤优势。但是,菌株cB1809在大豆根际的出现,使菌株PRC005的结瘤数和根瘤干重显著下降。菌株CB1809较高的根际菌数并没有显著地提高该菌的占瘤率。试验结果反映了菌株CB1809不适合大豆“矮脚早”品种的结瘤。     

花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MZ5 Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体的功能分析

【目的】探究慢生型花生根瘤菌Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作的功能。【方法】本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法,构建Bradyrhizobium sp. MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI突变体;荧光定量PCR检测添加大豆苷元(Daidzein)和染料木黄酮(Genistein)诱导物后野生型和突变株转录水平上ttsI的表达量变化及其差异;蛭石结瘤实验分析ttsI基因突变对花生结瘤能力的影响。【结果】在转录水平上,大豆苷元和染料木黄酮对MZ5的Ⅲ型分泌系统调节基因ttsI的表达具有显著的抑制作用(P0.05)。在MZ5△ttsI突变体中ttsI基因的表达量都明显下调,与野生型菌株的相比都达到极显著水平(P0.001)。蛭石结瘤实验表明,与野生型菌株相比,MZ5△ttsI突变体在不同花生品种的结瘤数和地上部干重都显著性降低。根瘤石蜡切片表明,MZ5△ttsI突变体在根瘤内的含菌量少于野生型菌株。【结论】Bradyrhizobium sp. MZ5菌株中的Ⅲ型分泌系统在花生-根瘤菌互作中对结瘤有积极的促进作用。     

氮素调控花生共生结瘤的机制研究进展

氮是花生生长发育所需的大量元素,共生结瘤固氮是花生获取氮素的主要方式之一。花生共生结瘤固氮涉及复杂的调控机理,揭示氮素对根瘤固氮的调控机制对发挥生物固氮潜力具有重要意义。本文系统总结了花生根瘤形成的“裂隙侵染”机制、花生共生结瘤和数量调控的机制以及氮素影响花生结瘤的调控机制。目前,氮素影响慢生根瘤菌与花生互作进而调控结瘤的分子机理尚不清楚,因此未来的研究重点应该集中在氮素影响花生慢生根瘤菌与花生的信号交流、根瘤数调节和营养交换机制等方面,为提高花生结瘤固氮效率和产量、减少化学氮肥施用提供理论基础。     

花生慢生根瘤菌的分离与鉴定

目的:从野生花生的新鲜根瘤中分离纯化花生慢生根瘤菌。方法:将野生型花生的新鲜根瘤灭菌后捣碎制成悬浮液,通过稀释涂布、划线和贴片三种方法,在YMA结晶紫和YMA刚果红选择培养基上逐步分离纯化得到单菌落。结果:三种方法均分离得到表面性状一致的单菌落,其中用稀释53~54倍的悬浮液划线分离的效果最好。所得菌株经理化性质和回接试验鉴定为慢生根瘤菌,从而为接着的花生根瘤菌及其结瘤基因的研究提供了基础。     

豇豆根瘤菌NGR234和紫云英根瘤菌109感染紫云英的比较研究

利用光学和电子显微镜对紫云英根瘤菌菌株109和广宿主的快生型根瘤菌菌株NGR234感染温带型豆科植物紫云英进行了研究,结果表明根瘤菌感染紫云英是通过在根毛中形成侵染线的途径。电子显微镜研究揭示了固氮根瘤中细胞内侵染线的存在。接种二天后,首先可观察到根毛的卷曲或分枝。接种四至五天后,在每株植物卷曲的根毛中可看到侵染线。接种八至十天后的植株出现肉眼可见的根瘤。菌株NGR234能够在紫云英上诱导根毛的卷曲,侵染线和根瘤的形成,但所形成的根瘤却未能固氮,根瘤中无明显的类菌体区,但有少数包有细菌的侵染线。NGR234抗抗菌素的衍生菌均未能使紫云英结瘤。将NGR234的共生质粒转移至三叶草、苜蓿、豌豆、快生型大豆根瘤菌和农杆菌,亦未能使这些细菌获得紫云英上结瘤的能力。     

花生根瘤菌与钼、硼复配的初步研究

针对四川花生主产区土壤缺硼、钼现状和花生对硼、钼的需肥特性,研究根瘤菌与Mo、B复配的可行性。供试慢生花生根瘤菌Spr2-9、Spr4-5耐硼、钼试验结果表明,根瘤菌耐硼能力远低于耐钼能力。“根瘤菌 Mo B”复合菌肥研制试验表明:根瘤菌不宜与硼复配,宜与Mo复配,与钼复配的适宜最高钼浓度以0.4%为宜。     

重组质粒pHN32对花生根瘤菌固氮的影响

通过三亲本杂交将大豆根瘤菌高效基因工程菌株HN32所携带的增效重组质粒pHN32引入一株快生型花生根瘤菌菌株85-7和另一株慢生型花生根瘤菌菌株co2-5中。花生盆栽结瘤试验结果统计分析表明:p的HN32载体质粒pLAFR1对根瘤菌85-7和co2-5的固氮功能没有影响;pHN32对85-7固氮影响不论在植株干重方面还是在固氮酶活方面统计学上都不显著;而对co2-5则植株干重提高了25.7％,存在极显著差异,固氮酶活尽管提高了51.8％,但统计学上不显著。根瘤中分离的Tc~r根瘤co2-5(pHN32)中的pHN32EcoR1酶切分析表明:pHN32没有发生结构上的变化且固氮增强作用可能由3.7kb外源片段引起。     

用AFLP技术研究花生根瘤菌的遗传多样性

采用AFLP分子标记技术,对分离自中国、津巴布韦、以色列的133株慢生花生根瘤菌(\%Bradyrhizobium \%sp.\%arachis)\%和13个代表菌株(\%Bradyrhizobium japonicum. Bradyrhizobium elkanii)\%的DNA扩增长度多态性进行了分析,并根据各供试菌株的遗传相似性进行了数值聚类。结果表明慢生花生根瘤菌群体内存在很高的遗传多样性,每个菌株的AFLP带谱均与其它菌株完全不同。AFLP技术简便、快速、重现性极高,能表现高信息量的DNA长度多态性,是目前研究生物群体内遗传多样性的最有效办法。     

重金属镉（cd）对花生结瘤和生长发育的影响

试验结果表明：重金属镉对“天府９号”、‘鲁花９号”花生品种的结瘤和植株生长均有影响。镉浓度在１００ＰＰＭ下,花生植株根系发育受到抑制,快生型花生根瘤菌株８５—７虽能侵染,但结瘤数量显著减少。     

哈茨木霉发酵液中肽类物质对豇豆土著根瘤菌竞争结瘤的影响

通过树脂吸附、离子交换、薄层层析、高效液相色谱系统以及紫外、质谱等分离、纯化和鉴别的方法,从哈茨木霉T2-16菌株发酵液中分离得到一种对豆科作物生长具促进作用的肽类物质。用该肽类物质对豇豆土著根瘤菌进行处理后,用AFLP技术研究了该物质对供试根瘤菌遗传稳定性和在土壤中竞争结瘤能力的影响。结果表明,传代次数和培养温度(28℃~36℃范围)对供试根瘤菌的遗传性状无明显影响,其AFLP指纹未发生明显变化;但经木霉肽类代谢产物处理后,根瘤菌竞争结瘤能力得到提高,为对照根瘤菌的1.53倍。