周围神经损伤后外源性GDNF对神经元的保护作用

采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型 ,局部给予胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) ,应用尼氏染色、酶组织化学染色方法 ,观察到外源性GDNF能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目 ,降低脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元中胆碱酯酶 (CHE)及酸性磷酸酶 (ACP)变化的幅度。这表明外源性GDNF能保护周围神经切断后引起的神经元损伤。     

GDNF对体外运动神经元和感觉神经元的影响

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对正常胎鼠脊髓运动神经元(SMN)和背根神经节神经元(DRG)生长活性的作用.方法:建立大鼠胚胎SMN和DRG单细胞培养体系,观察1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L和100 μg/L GDNF对SMN和DRG存活及突起生长的影响.结果: GDNF组培养的SMN和DRG存活数目明显增加,神经元突起长度比对照组明显增长,且具有剂量依赖趋势.结论: GDNF对正常大鼠胚胎发育期运动神经元和感觉神经元具有神经营养作用.     

器官型培养的脊髓与体内脊髓的对比

旨在观察体外器官型培养的脊髓薄片是否与同龄大鼠体内生长的脊髓具有相似的形态和恒定的前角a运动神经元数目,建立能模拟体内生长环境的稳定的脊髓器官培养模型。利用出生后8天乳鼠的腰段脊髓组织切片建立脊髓器官型培养模型,用神经元的特异性免疫组化染色SMI-32对脊髓前角a运动神经元加以鉴定并与同龄大鼠体内生长的脊髓做比较。结果发现脊髓体外生长良好,形态完整,a运动神经元数目恒定,与同龄大鼠比较无显著差异,并可长期存活达2个月。脊髓的器官培养技术为研究脊髓生理、病理改变及神经保护提供了有效的方法。     

胶质源性神经营养因子对不同组织细胞的影响

GDNF来自于小胶质神经元,首先作为中脑多巴胺能神经元的复活因子被发现,可促进细胞存活,并有增加多巴胺神经元细胞大小及轴突长度的作用。GDNF通过与锚定蛋白细胞表面受体糖基磷脂酰肌醇的相互作用来调节细胞活性。GDNF家族a-1受体,通过跨膜酪氨酸受体或者神经元细胞黏附分子,来促进细胞存活,神经突生长,以及突触发育。后续的研究提示,无论未成年还是成体大脑,GDNF对多种神经细胞都有复活的作用,并与一些周围神经复活、迁移、分化相关。不同的脑缺血实验模型均证实了外源性GDNF对于病灶部位及全脑的神经保护作用,包括局部应用营养因子,利用病毒载体运载GDNF基因以及移植表达GDNF的细胞。近来研究还证实,GDNF不仅对多巴胺能神经元,中枢和周围神经系统的运动、感觉神经元,以及自主神经元有营养和保护作用,对于非神经系统也有不同调节作用。本文将重点讨论这些GDNF作用的不同策略以及机制。     

GDNF与IL-1β体外诱导小鼠中脑神经干细胞分化作用的实验研究

目的研究神经干细胞在体外向多巴胺能神经元分化的条件,为帕金森病的细胞移植治疗提供基础实验资料。方法体外培养扩增中脑神经干细胞,在有血清条件下分别予以GDNF,IL-1β及GDNF IL-1β诱导分化,TH免疫细胞化学鉴定分化结果,流式细胞术检测TH阳性神经元比例。结果有血清条件下GDNF,IL-1β及两者联合促进中脑神经干细胞分化为TH阳性神经元的比例分别为13.41%,9.23%,15.59%,明显高于对照组(约3.49%,P≤0.01),GD-NF及联合诱导组多巴胺能神经元形态更成熟。结论GDNF,IL-1β及两者联合可明显促进中脑神经干细胞分化为多巴胺能神经元。GDNF较IL-1β更能促进诱导的多巴胺能神经元的表型成熟。     

脊髓提取液对培养脊髓神经细胞中GABA能及DYN能神经元突起生长的影响

本文以体外培养的小鼠脊髓神经元为模型研究了人胚脊髓提取液对E 12—15小鼠脊髓中GABA能神经元和DNY能神经元的突起生长的营养作用,结果发现人胚脊髓提取液在蛋白浓度为250μg/ml时对GABA能神经元的突起生长无营养作用,但对DNY能神经元的突起生长有显著的促进作用。提示了人胚脊髓提取液中有促进神经元突起生长的营养物质,且对特定胎龄的不同的神经元有不同的作用。     

脊髓内源性物质对脊髓神经元在体外存活的影响

神经元在体外的存活是衡量一种营养因子有无神经营养作用的重要指标之一。我们用人胚制备脊髓提取液,并用Centricon(Millipo-re)将粗提取液分成<10KD、10-30KD及>30KD三种组份,研究了粗提取液及这三种组份对体外培养中的脊髓神经元存活的影响,结果表明加粗提取液及<10KD的实验组比对照组活性要好,表现在线粒体中琥珀酸脱氢酶活性高(MTT法),神经元中NSE活性高(NSE-ELISA法)及细胞生长合成的总蛋白的量高等方面。但以<10KD组份对细胞的促活作用最强,与对照组相比有显著性差异。以上结果显示人胚脊髓中存在对脊髓神经元有促进存活的物质。     

重组人胶质细胞源性神经营养因子的生物学活性研究

从人星形胶质细胞瘤BT-325细胞中克隆胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) cDNA序列.以大肠杆菌作为表达系统,GDNF蛋白在大肠杆菌JM103中获得了高效表达;表达产物经纯化、复性后,以8日龄鸡胚背根节（DRG）、14日龄胎鼠脊髓前角运动神经元以及新生大鼠大脑皮层胶质细胞作为实验材料,研究了GDNF的生物学活性,结果表明： rhGDNF可有效地促进DRG突起的生长,rhGDNF对体外培养的运动神经元表现出明显的促突起生长作用,并可显著提高体外培养运动神经元的存活率,rhGDNF 对体外培养的胶质细胞具有促增殖作用.     

胶质细胞源性神经营养因子对疼痛的调节作用

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)属转化生长因子β超家族成员,其成熟蛋白由134个氨基酸残基组成,而GDNF受体广泛分布于外周和中枢神经系统。GDNF不仅可以促进多巴胺能神经元、运动神经元的存活,对交感、副交感以及感觉神经元具有营养作用,还能够影响神经元的发育、分化并对非神经系统的发育也具有重要作用。近年来随着人们对疼痛认识的深入,疼痛的机制也不再限于神经元功能的改变,还受胶质细胞活化、多种营养因子、细胞因子及相应受体、离子通道等多方面因素的影响。为此,本文就近年来GDNF参与疼痛调节的相关研究进展做一简要综述。     

人胶源神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

胶源神经营养因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是大鼠B49细胞系中分离纯化得到的一种蛋白质^[1],由于其对多巴胺神经元的专一性的神经营养作用而被发现。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸组成,具有两个N-糖基化位点。它属于TGF-β基因家族但与该家族其它成员的氨基酸序列同源性仅为20%,可能是一个新的亚家族。最近研究表明,它对发育中的运动神经元也有很强的神经营养作用^[1]。对啮齿类^[3,4],灵长类的弥猴^[5]的活体试验表明,胶源神经营养因子是一种治疗神经退化发夹知病如帕金森氏症、肌萎缩性脊髓索硬化症等的非常有效的潜在药物。由于GDNF在体内含量极低而且公在发育早期表达,因而只有通过基因工程方法才能获得大量的GDNF。本文报道采用PCR方法从中国入基因组DNA 中扩增出编码GDNF的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达。这为进一步研究GDNF的结构和生物学功能打下了坚实的基础。     

GDAF对原代培养脊髓神经元的影响

The effect of GDNF on long-term cultured spinal cord neurons was studied. GDNF could promote spinal cord neurons survival after 7 d or 14 d culture by MTT assay. The effect of GDNF on growth cones, neuron soma magnitude, neurite length and spines formulation of spinal cord neurons in cell culture was observed by phase microscopy, Nissl stain and NSE immunocytochemistry stain. The results indicated that GDNF had significant trophic effects on long-term cultured spinal cord neurons.     

周围神经损伤后外源性GKNF对神经元的保护作用

采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型,局部给予胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）,应用尼氏染色、酶组织化学染色方法,观察到外源性ＧＤＮＦ能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目,降低脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元中胆碱酯酶（ＣＨＥ）及酸性磷酸酶（ＡＣＰ）变化的幅度。这表明外源性ＧＤＮＦ能保护周围神经切断后引起的神经元损伤．     

离体培养的小鼠脊髓固有神经元的突触构筑

运用电子显微镜观察分析原代分离培养鼠胚脊髓的固有神经元的突触构筑。培养中主要可见中、小型神经元,彼此之间可形成大量的突触,以非对称性突触占多数,有轴-树突触和轴-体突触,树-树突触为少见。根据以前学者分类标准将终扣分成S、F、M、和G四型。超微结构有利于提示固有神经元经过简单突触从脊髓固有神经纤维接受突触传入,表示它们的冲动只是突触后机制控制信息传递。     

谷氨酸转运抑制剂对器官型培养脊髓片的影响

观察谷氨酸转运体抑制剂苏一羟天冬氨酸(Threo-hydroxyaspartate,THA)对器官型培养的脊髓片的影响,探讨谷氨酸在运动神经元损伤中的作用。取出生后8天乳鼠的腰段脊髓组织切片做脊髓器官型培养,在培养液中加入不同浓度THA(50μmol／L、100μmol／L、5001μmol／L),用神经元的特异性免疫组化染色剂SMI-32,非磷酸化神经丝标记物,对脊髓腹角α运动神经元进行鉴定,用单克隆抗钙网膜蛋白(calretinin)抗体对背角中间神经元进行记数,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,并与对照组比较。结果显示对照组α运动神经元数目恒定,THA可以引起剂量依赖性的培养液中LDH含量增高和α运动神经元数目减少,而脊髓背角的中间神经元损伤相对较轻,其中THA100μmol／L组在体外培养4周后出现类似于肌萎缩侧索硬化(ALS)的病理改变：α运动神经元数目较对照组明显减少,而脊髓背角的中间神经元数目无显著变化。细胞外谷氨酸增高主要对运动神经元造成损伤,脊髓运动神经元较感觉神经元对谷氨酸的兴奋毒作用更加敏感。     

Recombinant GDNF: Tetanus toxin fragment C fusion protein produced from insect cells

Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) has potent survival-promoting effects on CNS motor neurons in experimental animals. Its therapeutic efficacy in humans, however, may have been limited by poor bioavailability to the brain and spinal cord. With a view toward improving delivery of GDNF to CNS motor neurons in vivo, we generated a recombinant fusion protein comprised of rat GDNF linked to the non-toxic, neuron-binding fragment of tetanus toxin. Recombinant GDNF:TTC produced from insect cells was a soluble homodimer like wild-type GDNF and was bi-functional with respect to GDNF and TTC activity. Like recombinant rat GDNF, the fusion protein increased levels of immunoreactive phosphoAkt in treated NB41A3-hGFRα-1 neuroblastoma cells. Like TTC, GDNF:TTC bound to immobilized ganglioside GT1b in vitro with high affinity and selectivity. These results support further testing of recombinant GDNF:TTC as a non-viral vector to improve delivery of GDNF to brain and spinal cord in vivo.     

A combined Bodian-Nissl stain for improved network analysis in neuronal cell culture

Bodian and Nissl procedures were combined to stain dissociated mouse spinal cord cells cultured on coverslips. The Bodian technique stains fine neuronal processes in great detail as well as an intracellular fibrillar network concentrated around the nucleus and in proximal neurites. The Nissl stain clearly delimits neuronal cytoplasm in somata and in large dendrites. A combination of these techniques allows the simultaneous depiction of neuronal perikarya and all afferent and efferent processes. Costaining with little background staining by either procedure suggests high specificity for neurons. This procedure could be exploited for routine network analysis of cultured neurons.     

A Combined Bodian-Nissl Stain for Improved Network Analysis in Neuronal Cell Culture

Bodian and Nissl procedures were combined to stain dissociated mouse spinal cord cells cultured on coverslips. The Bodian technique stains fine neuronal processes in great detail as well as an intracellular fibrillar network concentrated around the nucleus and in proximal neurites. The Nissl stain clearly delimits neuronal cytoplasm in somata and in large dendrites. A combination of these techniques allows the simultaneous depiction of neuronal perikarya and all afferent and efferent processes. Costaining with little background staining by either procedure suggests high specificity for neurons. This procedure could be exploited for routine network analysis of cultured neurons.     

鞘内注射M受体和GDNF反义寡脱氧核苷酸抑制吗啡戒断大鼠蓝斑c-Fos表达

应用免疫组化方法观察鞘内注射毒蕈碱型乙酰胆碱(muscarinic acetylcholine receptor,M) 受体和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)反义寡脱氧核苷酸对吗啡戒断大鼠蓝斑(locus coeruleus,LC)区内Fos表达的影响。结果显示,鞘内注射M_2受体和GDNF反义寡脱氧核苷酸明显减少大鼠吗啡戒断症状评分值(n=6,P<0.05)。正常大鼠LC区神经元Fos基础表达较低,吗啡依赖大鼠LC区神经元Fos表达增加,吗啡依赖大鼠纳酪酮(4mg/Kg,ip)催促戒断后,Fos表达进一步增加;鞘内注射M_2受体和GDNF反义寡脱氧核苷酸处理后均减少吗啡戒断大鼠LC区神经元Fos表达(n=5,P<0.05)。而鞘内注射M_1受体反义寡脱氧核苷酸处理组LC 区神经元Fos表达较吗啡戒断组没有显著差异(n=5,P>O.05)。结果提示:脊髓M_2受体调节吗啡戒断时LC区的神经元激活,而这种神经上行性激活涉及神经元与胶质细胞之间的适应性调节。