地高辛标记探针在Southern杂交分析中的技术要点

外源基因是否成功导入受体材料的基因组中 ,必须从转化植株中找到分子生物学的检测证据。目前 ,PCR、Southern杂交等作为常用检测手段而被广泛采用。虽然 PCR技术可以快速得到结果 ,但是 ,以农杆菌介导的材料必须慎重这一结论 ,以免由于农杆菌污染造成假阳性。而 Southern分析由于操作程序繁琐 ,对植物基因组DNA的提取、纯化、酶切等技术要求较高 ,有时使杂交结果不甚理想。我们在植物基因转化的研究中 ,对荞麦 ,桑树 ,紫景天 ,洋麻等基因组 DNA的提取、纯化、酶切进行了探讨 ,对流程中的有关步骤进行技术改良 ,使酶切后的 PNA在凝胶…     

转基因甘蔗植株Southern杂交体系的优化北大核心CSCD

对甘蔗Southern杂交体系的优化,旨为转基因甘蔗Southern杂交鉴定分析提供参考。以转基因甘蔗为材料,就探针不同标记方法的比较、甘蔗基因组DNA的提取、基因组DNA酶切量、酶切时间及杂交过程等方面,对地高辛标记的Southern杂交技术进行了优化研究。结果表明,改良的CTAB法提取的甘蔗DNA能满足后期实验的要求;PCR法标记探针的效率较随机引物法标记探针的效率高,更适合用于Southern杂交;40μg的DNA在400μL酶切体系中,酶切10 h可获得良好的酶切效果;杂交温度40℃,杂交18 h,可获得清晰的杂交条带。     

用新法检测家蚕微孢子虫病

华南农业大学邱宝利和徐光耀二先生在用核酸分子杂交技术鉴别和检测家蚕微孢子虫病的研究上取得新进展。他们先用PCR技术合成一段317bp的DNA片段，并将其克隆到大肠杆菌E．Coli DH5A中，当这种片段集量很多时，再用地高辛(DIG)标记成探针，经点杂交和Southern杂交检测，得知此片段为家蚕微孢子虫(N．b．)所特有的。     

鸡卵黄DNA的存在、提取和特性分析

利用免疫细胞化学技术证实了鸡蛋卵黄球中DNA的存在 .利用Ficoll 40 0密度梯度离心纯化卵黄球并提取了DNA .限制性内切酶分析表明所得卵黄DNA是序列不均一的DNA分子群 .MspⅠ和HpaⅡ分析显示该DNA的甲基化程度极低 .Southern杂交表明卵黄DNA含有基因组DNA的一小部分序列 .并认为卵黄DNA是一种独特的有可能在鸡胚早期发育中发挥功能的DNA .     

橡胶树转基因植株Southern杂交体系的优化

以地高辛标记的Southern杂交技术已广泛应用于多个物种中。选择橡胶树为材料,就基因组DNA的提取、探针标记方法的选择以及具体的杂交操作过程等方面对该体系进行了优化。结果表明,至少40μg高质量的DNA在300μL的大酶切体系中,酶切12 h可获得良好效果;PCR法标记的探针杂交条带清晰、背景浅,其效率明显强于随机引物法标记的探针。本研究优化的体系信号强、背景浅和灵敏度高,为橡胶树Southern杂交鉴定分析提供参考。     

基于地高辛标记对小麦进行Southern杂交分析主要影响因素的优化和验证

以转基因小麦和野生型小麦DNA为材料,对利用地高辛标记对小麦基因组DNA进行Southern杂交分析的影响因素进行了优化研究,包括探针制备与纯化、样品DNA量、酶切体系、真空转印条件、杂交条件、免疫检测方法等。结果表明,对随机引物标记的模板和标记后的探针进行纯化可明显提高探针的标记效率,10μg高质量的DNA样品在80μl的体系中,酶切8～12h可获得良好的效果;真空转膜时使用碱性液比中性液获得的转膜效果更干净;试剂纯度、杂交温度及杂交炉转速等均对杂交效果产生重要影响;配合改进的CSPD涂布方法,使用化学发光检测系统比单纯使用X光片显像更易操作,背景更干净;本研究所优化的地高辛标记的小麦Southern杂交分析显示出较高的灵敏度和信噪比,结果稳定,可克服同位素标记对实验条件、设备及实验人员身体状况等限制,在普通实验室推广应用。     

琼脂糖凝胶直接杂交法

DNA印迹(Southern blot)杂交法是研究DNA分子结构,变异及其组成的一种分子生物学技术。自1975年闻世以来,在分子生物学,遗传学及分子病毒学等研究领域得到广泛应用,对这些学科的发展起了重要作用。由于该技术均需要首先将电泳后已变性的DNA从琼脂糖凝胶转移至支持膜上,因此,实验结果的好坏很大程度取决于吸印的效果,同时也受支持物     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取*

根据多年生植物组织富含多酚、多糖的具体特性,对现有的DNA提取方法进行了改进。通过增加提取缓冲液中b-巯基乙醇用量,简化氯仿/异戊醇抽提液步骤,改用经-20℃预冷异丙醇沉淀DNA等,对CTAB法加以改进。改进后方法具有以下优点：（1）获得的DNA质量良好,提取过程无明显的DNA降解,基本上排除了多酚物质的干扰;（2）用获得的DNA进行Southern杂交,可得到理想的杂交信号,可满足相关的分子研究要求;（3）操作简便。Abstract It is a difficult problem to isolate high quality DNA from plants containing a high contents of polyphenolics and polysaccharose, such as Actinidia plant. The protocol described in this paper is a modified CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) method. High quality genomic DNA can be isolated from Actinidia plant using the improved method. The DNA is good enough for Southern blot and other uses in DNA research. The protocol is also efficient for quick and macro-DNA extraction.     

水牛SRY基因的克隆及序列分析

根据荷斯坦牛SRY基因设计一对引物,采用聚合酶链式反应（PCR）技术,以中国沼泽型水牛（Swamp Buffalo）基因组DNA为模板,扩增得到SRY（Sex Deterimation region of Y chromosome）全序列约2005bp,其中1-504bp为5’启动子区,1196-2005bp为3’侧翼序列,在505-1195bp为SRY的外显子,编码229个氨基酸。在SRY HMG box区域设计探针,用地高辛标记后分别与雄性、雌性水牛基因组DNA进行Southern 杂交,结果显示该段序列只在雄性DNA样本中有杂交信号,证明SRY基因为雄性特异。BLAST比对结果显示与牛属动物SRY基因的同源性为96％,其中SRY基因HMG box区域同源性高达99%,说明SRY基因具有高度的进化保守性