改进大肠杆菌(E.coli)局限性转导实验的探索

在大肠杆菌(E.coli)局限性转导(restricted transduction)实验中,通常用λ噬菌体特异性转导半乳糖发酵基因(gal)的现象来说明转导的基本原理和掌握转导实验的基本方法。近年来,我们在指导学生进行这一实验过程中,对实验菌株的选择、噬菌体(λ)的诱导、噬菌体裂解液的效价测定和进一步提高转导频率等方面进行了一些改进,收到了较好的效果。本文     

五株大豆根瘤菌噬菌体的普遍性转导

本文研究了5种烈性大豆根瘤菌噬菌体在大豆根瘤菌菌株间的普遍性转导。噬菌体psc和psx能在慢生大豆根瘤USDA110菌株间转导营养缺陷型标记和卡那霉素抗性标记。快生大豆根瘤菌MD3菌株间可通过噬菌体pfm转导营养缺陷标记和卡那霉素抗性标记。噬菌体pfc和pfx可在快生豇豆根瘤菌ANU240及其变种ANU265间转导抗性基因和定位于共生质粒（sym质粒）上的结瘤基因（common nod）。所有转导频率均在10-6~10-7之间。用紫外线处理噬菌体裂解液可以相应提高转导频率。     

氨苄青霉素抗性基因从质粒ER396转座到φ80噬菌体基因组的研究

前已报道抗药质粒ER396(Tc~r、Ap~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)带有可转座的Ap抗性基因。我们用φ80噬菌体感染带有ER396质粒的大肠杆菌,分离出一株能高频转导Ap抗性的噬菌体φ80 Ap。从:(1)φ80 Ap噬菌体的Ap抗性转导子对φ80噬菌体超感染具有免疫能力;(2)φ80 Ap噬菌体在接种有Ap敏感的大肠杆菌软琼脂平板上形成的噬斑中85％以上的噬斑,其中心的溶原菌都获得了对卸的抗性;（3） φ80噬菌体抗血清能同时中和φ80 Ap噬菌休的幻抗性转导能力与噬斑形成能力等结果,我们推测φ80 AP噬菌体是由于可转座的AP抗性基因从ER396质粒转座到φ80噬菌体的基因组中而形成的。     

遗传学实验— 微生物实验

原理 所谓转导是指以噬菌体作为媒介将某一细胞（供 体）的基因导入另一细胞（受体）的过程。转导可以分 为两大类：(1)普遍性转导；(2）局限性转导。两者 主要区别是： 前者可转导供体细胞的任意一个基因， 后者只能转导供体细胞的某些特定基因。     

遗传饰变的微生物及其制备和使用方法(续)

四、微生物的基因型和表型特征的实验方法和结果,特别举出X1776为例来说明 (一) 材料和方法: 上文已经叙述了培养基、噬菌体和菌株(参见表1)以及转导、诱变突变体富集、。     

一个圆褐固氮菌的转导系统

分离了圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcus)无荚膜变异株Aw的营养缺陷突变株和不固氮突变株以及Aw的噬菌体。以Aw菌株为给体,Aw的各种突变株为受体,通过噬菌体转导,证明圆褐固氮菌噬菌体AC-5.1是一株普遍性转导噬菌体。通过AC一5.1的转导,这些突变株都能成为原养型并恢复固氮能力。     

短小芽孢杆菌的遗传转导

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)噬菌体PP5在碱性蛋白酶生产菌珠B.pumilus 289中能进行普遍性转导。PP5对于B.pumilus 289的营养标记的转导频率为10~(-6)转导子/PFU。对于B.pumilus 1037和B.pumilus 289之间的链霉素抗性标记的转导频率为10~(-4)至10~(-7)转导子/PFU。从而建立了一个新的B.pumilus遗传转导系统。     

温和噬菌体ρ11的分离纯化及其DNA的提取

枯草芽孢杆菌(Bacollus subtilis)温和噬菌体已广泛用于转导、转染、分子生物学和基因克隆等研究,但是它的分离和纯化尚有一定的困难。原因在于:1.和烈性噬菌体不同,高     

以温和噬菌体pll为载体克隆α-淀粉酶基因

温和噬菌体p11 DNA和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168染色体DNA用BamHl酶消化和T4 DNA连接酶连接,转化到被噬菌体p11溶源化了的501菌株中,经过体内交换整人到染色体上,培养48小时后,从1020个菌落中挑出含Arol+一Amy+基因的3个转化子,分别命名为p11Amy1、p11Amy2和p11Amy3。取p11Amy1进行繁殖和丝裂霉素c诱导,诱导后的重组噬菌体用于测定噬斑形成能力和转导活性,提取其DNA再用于转化,均证明构建成了含淀粉酶基因的重组特异性转导噬菌体。     

链霉菌基因转移的方法

本文介绍了用于链霉菌基因转移的各种方法 ,涉及原生质体转化、电穿孔、接合转移和噬菌体转导 ,对影响链霉菌基因转移的各种因素进行了分析。     

链霉菌基因转移的方法

本文介绍了用于链霉菌基因转移的各种方法,涉及原生质体转化,电穿孔,接合转移和噬菌体转导,对影响链霉菌基因转移的各种因素进行了分析。     

枯草杆菌的遗传学

高桥伊和夫（Iwao Takahashi）博士是加拿大McMaster大学生物系教授。枯草 杆菌的转导现象及其转导噬菌体PBS1就是由他发现的。高橘博士从事抱子形成遗传调节的 研究,曾绘制第一张抱子基因在染色体上的分布图。今牟四月,他应中国科学院遗传研究所的 邀请来华访问,这是他在访华期间所作的一篇报告。     

一株枯草芽孢杆菌原噬菌体Bsu-yong1的基因组分析

【目的】枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是在自然界中广泛存在的革兰氏阳性菌，其抗逆性极强，能抑制大多数有害菌的繁殖，是常用的产酶菌，用其生产的蛋白酶、淀粉酶占全球工业酶产量的50%。原噬菌体（prophage）整合在宿主基因组中，可为宿主提供基因和生物学功能，非常具有研究价值。以往，有关B. subtilis原噬菌体的报道主要集中于缺陷型原噬菌体（defective prophage），本研究对一株非缺陷型活性原噬菌体（active prophage）的基因组进行解析，以扩充对非缺陷型原噬菌体的认知。【方法】使用丝裂霉素C从枯草芽孢杆菌中诱导一株噬菌体，命名为Bacillus phage Bsu-yong1（简称Bsu-yong1）。对Bsu-yong1进行负染、透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）观察，用Illumina MiSeq测定其基因组序列、综合运用生物信息学工具对其进行基因功能注释和系统进化分析。【结果】Bsu-yong1与PBSX类缺陷型原噬菌体在形态上相似，但Bsu-yong1具有完整的噬菌体基因组，这与缺陷型原噬菌体不同，后者在包装过程中不能正确包裹自身的基因组，而是随机包裹一段宿主染色体。Bsu-yong1基因组全长为43 590 bp，G+C含量为41%，含有62个开放阅读框（open reading frame，ORF），呈模块化分布。Bsu-yong1拥有基因编码T7SS效应器LXG多态性毒素（T7SS effector LXG polymorphic toxin）、ImmA/IrrE蛋白和SMI1/KNR4蛋白。前二者为细菌毒素（toxin），后者为抗毒素（antitoxin），toxin-antitoxin是细菌免疫系统重要成员，参与菌间竞争与环境适应。此前，尚未有编码LXG polymorphic toxin的基因在噬菌体中被发现和报道。在基于全基因组比对构建的蛋白谱进化树（proteomic tree）中，Bsu-yong1与噬菌体sv105、rho14、vB_BteM-A9Y聚集形成一个独立的进化支（clade），基因组比对显示它们基因组的复制与调控模块具有高度保守性，它们共享29个核心基因（core gene），均具有PBSX样形态特征。Bsu-yong1与其他噬菌体的进化距离较远。将Bsu-yong1与所有噬菌体进行比对，得到的成对序列比较（pairwise sequence comparison，PASC）最大值为46.72%，小于属边界值（70%）。【结论】vB_Bsu-yong1在有尾纲中代表一个新的未知的属；建议构建一个新的科（family），该科由Bsu-yong1与噬菌体sv105、rho14、vB_BteM-A9Y组成。vB_Bsu-yong携带免疫相关基因，它可能有利于宿主在菌间竞争中获胜和适应环境。本研究丰富了噬菌体基因数据库，拓展了对芽孢杆菌活性原噬菌体的认知。     

脂多糖保守表位模拟肽的筛选与鉴定

用针对脂多糖保守表位的单抗2B4对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,通过噬菌体ELISA实验及脂多糖(LPS)竞争抑制实验鉴定阳性克隆.经三轮筛选后,与抗体结合的噬菌体得到明显富集,噬菌体ELISA结果显示,阳性率达80%.将其中12个阳性噬菌体克隆做鼠伤寒杆菌和大肠杆菌LPS竞争抑制实验,抑制作用非常明显,有良好的剂量依赖关系,证明这12个克隆与LPS具相似表位.DNA测序并推导噬菌体展示肽的氨基酸序列为,GPPQWFFSQPQL（5/12,41.7%）,LPQYFWNTATTA （3/12,25%）,FPQNHWNVPWAT（2/12,16.6%）,HSQSFWNAPLAM和AHPWTHGYFPPL（1/12,8.3%）.实验结果表明,用2B4抗体筛选到的噬菌体短肽克隆可模拟保守表位,即脂多糖的模拟肽（位）.     

脂多糖保守表位模拟肽的筛选与鉴定

用针对脂多糖保守表位的单抗2B4对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,通过噬菌体ELISA实验及脂多糖(LPS)竞争抑制实验鉴定阳性克隆.经三轮筛选后,与抗体结合的噬菌体得到明显富集,噬菌体ELISA结果显示,阳性率达80%.将其中12个阳性噬菌体克隆做鼠伤寒杆菌和大肠杆菌LPS竞争抑制实验,抑制作用非常明显,有良好的剂量依赖关系,证明这12个克隆与LPS具相似表位.DNA测序并推导噬菌体展示肽的氨基酸序列为,GPPQWFFSQPQL（5/12,41.7%）,LPQYFWNTATTA（3/12,25%）,FPQNHWNVPWAT（2/12,16.6%）,HSQSFWNAPLAM和AHPWTHGYFPPL（1/12,8.3%）.实验结果表明,用2B4抗体筛选到的噬菌体短肽克隆可模拟保守表位,即脂多糖的模拟肽（位）.     

金黄色葡萄球菌中PVL基因与噬菌体DNA的同源性

为了探讨金黄色葡萄球菌PVL基因与噬菌体的相关性,从4株含有PVL基因的菌株中分离出DNA,用HindⅢ或EcoRI酶切后,分别与PVL和Lukm-lukF-PV探针进行Southern印迹杂交,以及对含有PVL基因及其下游区域的片段克隆、测序和同源性分析。结果表明3株菌的PVL基因及其下游区域的序列与V8菌株噬菌体ΦPVL的PVL基因及其下游噬菌体stt site的序列一致。另一菌株的LukM-lukF-PV基因与ΦPVL,的PVL基因有78％的同源性,并且在LukM-lukF-PV基因的下游区域发现与金黄色葡萄球菌噬菌体Φ11整合位点有98％同源性的序列,根据PVL基因存在于噬菌体的基因组上,推测可通过噬菌体转导在金黄色葡萄球菌中传播。     

BLyS对噬菌体随机12肽库的筛选

用B淋巴细胞刺激因子（BLyS）对噬菌体随机12肽库进行亲和淘洗,3轮筛选后阳性噬菌体得到富集。用ELISA鉴定噬菌体克隆,多个阳性克隆测序后得到了同一个小肽序列(RHKIQLRQNIIT)。将该小肽与GST融合,在大肠杆菌中进行表达及纯化,ELISA实验进一步验证了其具有与BLyS特异结合的活性。该小肽有可能成为其天然受体的拮抗剂。      

双报道基因系统的构建以及在N蛋白生物功能研究中的应用

为研究 λ噬菌体调控因子 Ｎ 蛋白的生物功能,应用 λ噬菌体感染、 Ｐ１ 噬菌体转导、体内、体外重组方法,通过对遗传标记的筛选,将 ｌａｃ Ｚ 和 ｇａｌ Ｋ 报道基因、λ噬菌体 ｐ Ｌ 操纵子负责调控转录、翻译的 Ｄ Ｎ Ａ 序列以及转录终止子装配到大肠杆菌染色体上,构建成菌株 Ｚ Ｈ１０４１、 Ｚ Ｈ１０４２ 和 Ｚ Ｈ１１４２．应用 Ｚ Ｈ１１４２ 菌株模拟 λ噬菌体的自然状态对其调控蛋白 Ｎ 的生物功能进行了研究．研究证明, Ｎ 蛋白不仅在转录水平上正向调控基因表达,还具有一种新的在翻译水平上负向调节自身基因表达的生物功能．     

噬菌体Z基因组生物合成通路的研究进展

噬菌体基因组中存在丰富的碱基修饰，主要用于逃避宿主内切酶的切割。40多年前，在蓝藻噬菌体S-2L的DNA中，研究者发现2-氨基腺嘌呤(Z)完全取代腺嘌呤(A)，与胸腺嘧啶(T)形成具有三根氢键的互补配对，形成了特殊的Z基因组。近年来，研究者在多个噬菌体中发现并证实了噬菌体Z基因组生物合成通路。该通路是一个多酶系统，其中包含由噬菌体DNA编码的2-氨基脱氧腺苷琥珀酸合成酶(PurZ)、脱氧腺苷三磷酸水解酶(dATPase/DatZ)、脱氧腺苷/脱氧鸟苷三磷酸的焦磷酸水解酶(DUF550/MazZ)和DNA聚合酶(DpoZ)。本文在简述噬菌体中各种修饰核苷发现历史的基础上，详细介绍了Z基因组生物合成通路中多种酶的研究进展，最后对Z基因组及其合成通路中多种酶的应用进行了展望，以期为该领域的研究提供借鉴和参考。     

大肠杆菌O157噬菌体中vt2基因A、B亚单位的克隆与序列分析

根据GenBank中毒素基因 vt1、vt2序列设计合成 4 对引物,以大肠杆菌 O157 菌株 DNA为模板,扩增 vt1、vt2,从只含有vt2的菌株中诱导释放噬菌体,以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,获得vt2、vt2 A、vt2 B 3条特异性DNA带;将 vt2 A、vt2 B扩增产物纯化后,分别插入 pMD18 T载体,测序结果与相应序列比较,vt2 A和 vt2 B亚单位的基因序列与 GenBank中编码 VT2 毒素的 A、B亚单位的核苷酸序列(X07865,NC_002655, BA000007,AF291819)的同源性分别为98%~99%、96%~100%,确定 vt2 位于噬菌体,并为进一步研究大肠杆菌 O157 中VT噬菌体的毒力转导、VT2毒素的表达和应用奠定基础。