大肠杆菌表达的人IL-6复性条件研究

采用稀释法复性,筛选重组人白细胞介素-6(rhIL-6)包涵体蛋白的复性条件。结果显示,复性液的浓度、pH值、复性时间和复性蛋白浓度,对重组人白细胞介素-6复性效果有很大影响。在复性液为2mol/L尿素、pH8.5、复性时间为24h和复性蛋白浓度50μg/ml条件下,重组人白细胞介素-6包涵体蛋白的复性效果最佳。     

人血小板衍生生长因子BB亚型包涵体复性与纯化

目的:优化人血小板衍生生长因子BB亚型(PGDF-BB)包涵体复性方法与纯化条件,获得具有较好生物活性的重组PGDF-BB蛋白。方法:对PGDF-BB包涵体以梯度尿素进行变性,选择最佳包涵体变性浓度;比较不同复性条件下的复性率,稳定PGDF-BB包涵体复性方法;参照该蛋白的理化性质,选择适合PGDF-BB重组蛋白的纯化方法。结果:原核系统内实现了PGDF-BB的高表达;通过优化包涵体复性方法,重组蛋白的包涵体复性率可达40%以上;经过多个纯化方法相结合,PGDF-BB的纯度达到95%。结论:通过实验条件的优化,提高了PGDF-BB包涵体复性率,获得高纯度、高生物活性的重组PGDF-BB蛋白。     

大肠杆菌表达的重组琼胶酶包涵体的纯化与复性条件研究

琼胶酶(agarase)是一类能够降解琼脂糖的糖苷水解酶,在保健食品、医药、化妆品等行业极具应用价值。本研究旨在纯化大肠杆菌BL21(DE3)ply Ss表达的以包涵体状态存在的重组琼胶酶rAga0917,并对纯化的包涵体蛋白的复性条件进行优化,以获得大量高活性的琼胶酶蛋白。用单因素实验,每次以单一复性条件为变量,用透析复性法探索了初始蛋白浓度、透析时间、温度、非离子去垢剂Triton X-100、甘油等对重组琼胶酶rAga0917包涵体复性的影响。实验结果显示,通过Ni~(2+)柱亲和层析,获得了纯度95%以上的蛋白。纯化蛋白浓度低于65μg/m L时,复性蛋白的酶活性与初始蛋白浓度成正比;4℃复性的蛋白,其琼胶酶活性明显高于25℃;随着透析时间的增长,复性效果越来越好;实验还同时发现复性液中的甘油能有效地辅助重组琼胶酶rAga0917复性。     

重组GM—CSF／IL—3融合蛋白的纯化

重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素３（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白是一种很有发展潜力与应用前景的重组药物,它在大肠杆菌中是以饱含体形式表达的,针对这一重组蛋白饱含体的洗涤、变性、复性以及最终的纯化过程,进行了深入地研究,重点分析和比较了不同条件及因素对于重组蛋白包含体变性及复性过程听影响。实验结果表明,８ｍｏｌ／Ｌ尿素及１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ可以使包含体充分溶解。在复性过程中,采用     

蛋白质层析柱复性及工艺评价

蛋白质复性工艺的研究一直是重组蛋白药物研发领域的热点。稀释复性法和透析复性法的蛋白损失较大、复性得率不理想,而层析柱可以完成复性同时纯化,并能在高蛋白浓度条件下得到较高的复性率,有利于规模放大,是近年来最受关注的复性工艺。就层析柱复性工艺进行了归纳,包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析的复性,并对其复性原理及各自的优缺点进行了比较分析,最后从复性工艺的有效性、优越性以及对于规模化生产的适用性三个角度论述复性工艺的评价方法。     

精氨酸、精氨酸盐酸、半胱氨酸、胱氨酸对重组人tPA蛋白复性的影响

以重组人tPA蛋白为材料研究了精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸对蛋白质复性效果的影响,重组tPA蛋白包涵体经尿素变性溶解后,在精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸存在的条件下进行复性,结果表明,碱性的精氨酸在质量分数0.2%时可减少蛋白质凝聚,显著提高复性效果,tPA复性后的活性可提高50%以上,半胱氨酸单独使用具有类似β-巯基乙醇的作用,精氨酸盐酸盐和胱氨酸单独使用对复性无影响,而半胱氨酸和胱氨酸联合使用,有类似氧化-还原系统作用。可提高活性20%。     

重组人尿激酶原的体外变复性研究

重组人尿激酶原在大肠杆菌中过量表达时形成不溶物包涵体,需经体外变复性后才能获得生物活性。本文旨在提高包涵体中变性尿激酶原的复性效率,通过对pH,温度,变性剂种类及浓度,蛋白浓度,以及巯基氧化还原对的比率等的定性定量分析,研究重组人尿激酶原体外变复性的基本条件,并比较了添加某些非特异有效成分,脉冲稀释,梯度透析等方法对提高重组人尿激酶原体外变复性效率的作用。确定了重组人尿激酶原体外变复性的适宜方法,复性效率可达20%～30%。     

重组蛋白包涵体的复性研究

重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往形成不可溶、无生物活性的包涵体,需经过变性溶解后,在适当条件下复性形成天然的构象,才可恢复其生物活性．变复性实验是建立在对蛋白质体外折叠机制的了解的基础上．根据近年来对蛋白质折叠机制的认识和重组蛋白包涵体在复性方面的主要进展,论述以下3个方面的内容：1)蛋白质在细胞内的折叠机制;2)蛋白质体外折叠机制;3)蛋白质复性的策略和方法．     

重组融合蛋白Trx-IFN-CSP复性工艺研究

旨在建立并优化融合蛋白Trx-IFN-CSP的复性工艺。对重组融合Trx-IFN-CSP进行体外复性研究,考查p H、温度、蛋白浓度、氧化还原体系及辅助复性小分子等复性条件对融合蛋白重折叠的影响。结果显示,适合Trx-IFN-CSP复性的方法为,反复冻融联合超声破菌获得包涵体;用含有1%Triton X-100、2 mol/L尿素、2%DOC洗涤液初步纯化包涵体;再用6 mol/L盐酸胍溶解液变性包涵体;脉冲加样稀释变性液后4℃条件下梯度透析复性,使用L-Arg辅助复性。经肠激酶切去Trx标签后,每升发酵液最终获得110-130 mg肝靶向干扰素,每批蛋白纯度都在95%以上,比活性在1.9-2.4×108 U/mg之间,制备工艺稳定。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

A REINTERPRETATION OF THE ONTOGENY OF THE ASCOCARP OF SPECIES OF THE ERYSIPHACEAE

A study of four species of Erysiphaceae (Uncinula salicis, Podosphaera leucotricha, Erysiphe cichoracearum, and Microsphaera diffusa) revealed that the binucleate stages of the ascocarp are initiated in a similar manner to those of Diporotheca rhizophila Gordon & Shaw. The “appendages” developing on immature ascocarps are considered to be receptive hyphae. Appendages characteristic of mature ascocarps are produced much later. Lysis of certain centrum cells occurs, and asci are initiated from some of the remaining binucleate centrum cells. Resorption of centrum cells by the asci is supported by this investigation, corroborating Björling's earlier studies on Erysiphe graminis.