钠离子通道NaV1.7与神经病理性疼痛

钠通道NaV1.7是电压门控性钠通道的亚型之一。大多数钠离子通道NaV1.7表达在背根神经节(DRG)小C纤维的伤害性感受器上,具有缓慢开放和缓慢关闭失活的特点。它能够产生大量的斜坡电流,降低感觉神经元中动作电位产生的阈值,放大外来小的缓慢的去极化斜坡电流,从而增加神经元兴奋性,对疼痛的产生、传递、调节具有关键性作用。随着遗传学研究的不断深入,钠离子通道NaV1.7的功能获得性突变和功能缺失性突变,使其成为了新型镇痛疗法中一个的特别有吸引力的药物靶点,受到人们的广泛关注。而研究发现,NaV1.7通道在不同因素引起的神经病理性疼痛中通过不同途径提高神经元兴奋性,参与神经病理性疼痛,给NaV1.7选择性抑制剂研发带来了巨大阻碍。目前,虽然已有的NaV1.7选择性抑制剂具备有效镇痛作用,且无明显副作用或成瘾问题,但寻找NaV1.7选择性配体极其困难。此外,现有的NaV1.7选择性抑制剂也因神经病理性疼痛类型的不同在抑制效力、靶向性、安全性以及可行性等方面存在差异。提示寻找NaV1.7通道作用于不同神经病理性疼痛的普遍机制或NaV1.7通道特有的受体结合位点,可能是未来NaV1.7选择性抑制剂研发的主要方向。本文就NaV1.7通道在不同因素引起的神经病理性疼痛中的主要作用进行简要综述。     

全面性癫痫伴热性惊厥附加症SCN1A基因G302D突变的膜片钳电生理研究

目的:探讨全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)SCN1A基因G302D突变的电生理机制。方法:采用体外定点诱变法构建携带有基因突变G302D的pCMV-SCN1A的表达载体,lipo2000脂质体转染法共转染pCMV-SCN1A-G302D质粒和pCD8-IRES-SCN1B质粒到HEK-293细胞系,进行全细胞膜片钳电生理实验记录Navl.1通道电流及动力学参数,由pClamp10.0以及OriginPro8.0软件分析。结果:SCN1A-G302D突变体与野生型相比,电流密度降低,激活速度减慢,失活后恢复时间延长。失活参数两者相比没有显著性统计学差异。结论:SCN1A基因G302D突变导致Navl.1通道功能部分丧失,可能是导致GEFS+的病因。     

SCN5A基因突变与遗传性心脏疾病的相关关系

SCN5A基因编码心脏钠离子通道Nav1.5的α亚基,主要与心脏动作电位的快速去极化有关,是最早研究的离子通道之一。SCN5A的突变和众多遗传性心脏疾病的电生理和结构表型有很大的相关性。其功能丧失突变与Brugada综合征、进行性心脏传导障碍、病窦综合征、特发性心室颤动和心房静止有关,而功能获得突变与长QT综合征3型相关。其他与SCN5A相关的疾病,如心房颤动,婴儿猝死综合征,扩张型心肌病,以及致心律失常性右室心肌病,重叠综合症,都有更复杂的病理生理机制,涉及多种分子表型的变化。随着膜片钳技术和诱导多能干细胞定向分化为心肌细胞(i PSC-CMS)技术的发展,SCN5A基因突变导致遗传性心脏疾病的致病机制已取得较大进展,根据最近的发现,本文主要对近年来SCN5A基因突变导致各种遗传性心脏疾病中的研究进展做一总结。     

In-Fusion 技术构建Ⅰ型钠通道与绿色荧光蛋白融合表达及其突变载体

目的：构建Ⅰ型钠通道(Nav1.1)与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体及其突变载体。方法：利用In-Fusion 技术将SCN1A 基 因亚克隆到绿色荧光蛋白真核细胞融合表达载体（pAcGFP1-C In-Fusion Ready Linear Vector）。PCR 扩增SCN1A 基因（与线性载 体对应两端有15 个相同碱基）,In-Fusion 技术进行融合即得到pCMV-GFP-C-SCN1A。将其转染HEK293T 细胞,Western blot 检 测Nav1.1 的表达。定点诱变试剂盒对其进行定点诱变。结果：1.成功构建Nav1.1 与GFP 融合表达载体pCMV-GFP-C-SCN1A;2. DNA 测序表明：在预期位点已经发生突变,SCN1A 基因第190 位色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TGA)。结论：Nav1.1 与 GFP 融合表达载体及其突变载体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致Nav1.1 功能的改变奠定了基础。     

钠通道基因SCN5A突变与扩张型心肌病

心脏钠通道基因SCN5A突变可以导致多种心律失常,近年研究发现该基因突变与扩张型心肌病也有关,但致病机制不甚清楚。本文通过比较与扩张型心肌病有关的多个已发现SCN5A突变的电生理特点,提出该基因突变可能通过改变细胞内钠浓度来影响细胞内钙稳态而导致扩张型心肌病;新近发现的A1180V突变携带者表现出的异常心电图,很可能为某些扩张型心肌病患者进行早期诊断,提供一种有效而简便的方法。     

结合单酶切位点的融合PCR技术对SCN1A基因的定点诱变

目的:利用结合单酶切位点的融合PCR技术对癫痫相关基因SCN1A进行定点突变。方法:首先设计两对引物PF1/PR1和PF2/PR2,PF1和PR2均位于突变位点最近的单酶切位点处,而突变位点设计在第一对反向引物(PR1)和第二对正向引物上(PF2)。通过重叠延伸法两次PCR扩增:第一次用PF1/PR1和PF2/PR2分开扩增,以扩增产物作模板,PF1/PR2作引物进行融合PCR,得到的扩增产物即含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pMD18-T载体,经测序筛选阳性克隆。结果:DNA测序表明SCN1A基因所编码的第946位密码子由精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His),再通过酶切和连接反应将重组质粒上的突变片段替换SCN1A表达质粒上的对应片段,成功构建了SCN1A突变载体。结论:与现在常用的长距离PCR定点诱导突变相比较,结合单酶切位点的融合PCR定点突变技术具备扩增距离短的优点,大大降低了自发突变的概率,适合于大肠杆菌中易自发突变的较大载体的定点诱变。     

编码脑组织Nav1.5钠通道新外显子的克隆、鉴定和分布

Nav1.5电压-门控钠通道(VGSC)被认为是心肌的特异性通道,但最近的研究发现,该通道在脑组织尤其是边缘系统中亦广泛分布.此前,在对人神经母细胞瘤细胞钠通道的基因克隆中,发现Nav1.5/SCN5A基因的第6A外显子参与编码该通道.采用人及鼠脑组织,通过RT-PCR法对Nav1.5钠通道基因进行克隆发现:Nav1.5/SCN5A基因中的第6A外显子参与编码了该通道,而心肌等其他组织却是第6外显子参与编码该通道.人Nav1.5/SCN5A基因的第6A和第6外显子都定位于3号染色体,共有92个碱基,都可以编码产生30个氨基酸,但却有7个氨基酸不同.人和鼠脑组织Nav1.5/SCN5A基因的第6A外显子仅有一个碱基不同,却产生相同的氨基酸序列.RT-PCR法证实第6A外显子在鼠脑的不同部位表达不同,第6外显子在大鼠不同组织中的表达也不同,这为深入研究不同系统中Nav1.5钠通道的功能提供了基础.     

可可西里核心区发现双壳类海洋生物化石

英国剑桥大学的杰弗里·伍兹领导的科研小组对巴基斯坦6名年龄在4～14岁的儿童进行研究后发现，他们体内一个名为SCN9A的基因发生突变，使他们无法感觉到疼痛，但身体其他感觉却保持正常。     

13例SCN2A 基因突变相关儿童神经系统疾病表型分析

摘要 目的：总结并分析SCN2A基因突变引起的儿童神经系统疾病相关表型谱特点。方法：采用回顾性研究,收集2018年6月至2021年6月在上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心神经内科诊治的患儿,并经二代基因测序检测,纳入SCN2A基因突变者,研究并总结患儿神经系统临床表型特点。结果：共纳入13例SCN2A突变患儿,包括新生突变9例和遗传性突变4例。其中11例患儿伴有癫痫发作,发作年龄为1日龄~1岁11月龄,4例在新生儿期起病 （36%）,1~3 月龄起病2例（18%）,4~12月龄起病2例（18%）,1岁后起病3例（27%）;发作类型中强直阵挛发作、痉挛发作、局灶性发作均各有4例（36%）,阵挛发作1例（9%）。另有2例无癫痫发作的患儿,1例表现为全面性发育迟缓,另一例表现为发育迟缓合并孤独症谱系疾病。11例癫痫患儿中,丛集性发作患儿10例。遗传性突变4例患儿中2例智力、运动发育正常;9例新生突变的患儿中8例伴有运动、智力发育落后,1例发育正常。11例癫痫患儿表型中良性家族性新生儿癫痫1例,新生儿惊厥2例,婴儿痉挛症2例,不能分类的早发性癫痫性脑病3例,儿童期起病的癫痫性脑病2例,热厥附加症1例。结论：SCN2A基因突变引起的儿童神经系统疾病以癫痫表现居多、癫痫表型谱广,少数表现为不伴癫痫发作的发育迟缓和孤独症谱系疾病。     

POLG1外显子1、3、4、7突变与弱精子症的相关性及其对mtDNA和4977bp缺失的影响

为了探索POLG1外显子1、3、4、7突变与弱精子症的相关性及对mtDNA序列突变和4977bp缺失的影响,按WHO标准收集了120例弱精子症和101例精子活力正常的精液标本,经PCR测序分析POLG1外显子1、3、4、7突变,继而测序检测9例外显子4c．948G〉A突变的弱精子症标本、9例无C．948G〉A突变的弱精子症标本和9例正常对照标本的mtDNA全序列,利用巢式PCR技术分析94Pie．948G〉A突变标本、9例无C．948G〉A突变的弱精子症标本和9例对照标本的4977bp缺失。结果显示：在120例弱精子症中发现P说G,外显子4c．948G〉A突变9例（7．5％）,显著高于对照组（0％,P〈0．05）。c．948G〉A突变组mtDNA全序中突变率与对照组比无统计学差异俨〉0．05）。作者关注的两组中,突变数有差异的位点累积突变频次突变组显著高于对照组俨〈0．05）,但与无C．948G〉A突变的弱精子症标本的累积突变频次比较无统计学意义;突变组mtDNA4977bp缺失率（7／9,77．8％）显著高于对照组（2／9,22．2％,P〈0．05）和无c．948G〉A突变的弱精子症组（2／9,22．2％,P〈0．05）。以上结果提示,弱精子症的发生可能与POLG,c．948G〉A突变有相关性,弱精子症线粒体DNA某些位点的累积突变率增高,但可能不是POLGlc．948G〉A突变引起;c．948G〉A突变可能会增加mtDNA4977bp缺失,从而影响精子线粒体功能,导致精子活动力下降。