逆境处理和DNA甲基化影响柑橘体细胞胚发生

对 1 5种柑橘胚性愈伤组织进行体细胞胚诱导 ,发现逆境处理有利于体细胞胚发生 ,并可以恢复部分品种的体细胞胚发生能力。对具有和失去体细胞胚发生能力的两种纽荷尔脐橙 (CitrussinensisOsb .)愈伤组织进行随机扩增多态性DNA (RAPD)分析没有检测到带型的差异 ,而对它们的甲基化敏感扩增多态性 (MSAP)进行分析则发现两种愈伤组织间具有明显的DNA甲基化差异 ,具体细胞胚发生能力的愈伤组织的甲基化水平较失去体细胞胚发生能力的低     

橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析

为探讨巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)自根幼态无性系与供体间差异产生的原因,应用甲基化敏感扩增多态性扩增技术,对巴西橡胶树体细胞胚发生过程中基因组DNA 胞嘧啶甲基化程度和模式进行了分析。结果表明,在巴西橡胶树体细胞胚发生过程中不同阶段的DNA 甲基化程度不同,以花药的DNA 甲基化程度最高,体细胞胚的DNA 甲基化水平最低。在体细胞胚发生过程中出现了I、Ⅱ和Ⅲ 3 种类型的甲基化多态性带型的改变,包括他们的出现与消失。因此,橡胶树体细胞胚发生过程中可能通过DNA 甲基化甲基化和去甲基化来调控基因的表达。     

欧石楠体细胞胚发生过程中的DNA甲基化

利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）方法,对欧石楠大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的DNA甲基化进行了研究。从64对选扩增引物中筛选出19对,共扩增得到506条带,统计显示,大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的全基因组DNA甲基化水平分别为31．42％、27．86％和29．05％,3种试材发生甲基化变异的有175条带,变异率为34．58％。体细胞胚诱导形成胚性愈伤组织过程中,甲基化水平降低,而在再生苗中有所恢复,与大田苗接近。在外侧胞嘧啶甲基化水平上,胚性愈伤组织的甲基化水平有所增加,且在再生苗中可部分维持。另外,在175条变异带中,再生苗恢复到大田苗DNA甲基化模式的有62条,占总变异条带的35．43％,而与胚性愈伤组织维持相同DNA甲基化模式的有59条,占33．71％。回收部分甲基化变异条带,最终得到8条有效的基因组DNA序列。BLASTnI：对分析表明,在欧石楠基因组中,包括抗性基因、蛋白激酶、质体基因等在内的多种DNA序列均存在DNA基化修饰现象。     

红豆杉脱分化过程中的遗传和表观遗传变异

采用扩增片段长度多态性（AFLP）和甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术分析红豆杉脱分化前后基因组DNA和DNA甲基化状态的变化。选用32个AFLP引物组合从红豆杉植株及其愈伤组织分别扩增出1834个片段,无多态性片段产生。这说明红豆杉植株在诱导形成愈伤组织的过程中基因组DNA保持高度的遗传稳定性。另用32个MSAP引物组合从红豆杉植株及其愈伤组织分别扩增出1197个片段,总扩增位点的甲基化水平由脱分化前的12．4％上升为16．2％,表明红豆杉在脱分化过程中的某些位点发生了甲基化。红豆杉脱分化前后的DNA甲基化模式也存在较大差异,说明DNA甲基化对愈伤组织形成有调控作用。     

高粱不同类型胚性和非胚性愈伤组织的生理生化差异

植物体细胞胚胎发生过程中伴随着复杂的生理生化变化,为进一步揭示胚性愈伤组织的再生潜力,该研究以高粱Sb19未成熟胚诱导产生的两种胚性愈伤组织和一种非胚性愈伤组织为材料,通过测定各愈伤组织中可溶性蛋白、游离脯氨酸和可溶性糖的含量,采用方差分析法对高粱体细胞胚胎发生过程中不同类型愈伤组织的生理生化指标进行了差异比较研究。结果表明:(1)高粱两种胚性愈伤组织中可溶性蛋白、游离脯氨酸和可溶性糖的含量均显著高于非胚性愈伤组织,表明胚性愈伤组织中的代谢活性高于非胚性愈伤组织,能够为体细胞胚胎发生提供更多的物质能量基础。(2)两种类型胚性愈伤组织之间生理生化差异显著,其中,Ⅱ型胚性愈伤组织中可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均显著高于Ⅰ型胚性愈伤组织,相反,Ⅱ型胚性愈伤组织中可溶性糖含量显著低于Ⅰ型胚性愈伤组织,这种生理生化差异在一定程度上影响了后期的分化。该研究结果为愈伤组织的胚胎发生能力与生化代谢的关系提供理论依据。     

香果树体细胞胚胎发生过程中4种同工酶的研究

用非变性聚丙烯凝胶电泳技术对香果树体细胞胚胎发生及形态建成过程中过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、淀粉酶(AMY)和超氧化物歧化酶(SOD)4种同工酶进行分析.结果表明:香果树体细胞胚胎发生及形态建成过程中,POD、EST、AMY和SOD活性变化与胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生发育密切相关.非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织酶谱差异明显,胚性愈伤组织中EST和AMY同工酶酶带多且活性高,非胚性愈伤组织中缺乏EST和AMY同工酶表达,AMY同工酶可作为胚性细胞分化和发育的重要标志.香果树体细胞胚形态建成过程中,球形胚时期的AMY、POD、EST同_T酶活性最强,表明这一时期生理代谢旺盛,是体细胞胚形态建成的关键时期;POD、AMY和SOD 3种同工酶的酶谱及表达强弱在形态建成的不同时期呈现有规律的变化,可作为香果树体细胞胚发生发育特定时期的参考标记. 与胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生发育密切相关.非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织酶谱差异明显,胚性愈伤组织中EST和AMY同工酶酶带多且活性高,非胚性愈伤组织中缺乏EST和AMY同工酶表达,AMY同工酶町作为胚性细胞分化和发育的重要标志.香果树体细胞胚形态建成过程 ,球形胚时期的AMY、POD、EST同_T酶活性最强,表明这一时期生理代谢旺盛,是体细胞胚形态建成的关键时期;POD、AMY和SOD 3种同工酶的酶谱及表达强弱在形态建成的不同时期呈现有规律的变化,可作为香果树体细胞胚发生发育特定时期的参考标记. 与胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生发育密切相关.非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织     

植物胚性愈伤诱导的机理及提高途径

对植物胚性愈伤诱导的研究结果进行综合分析,寻找植物胚性愈伤诱导参与的基因、诱导的机理、甲基化与提高植物胚性愈伤诱导途径之间的联系,探索提高植物胚性愈伤诱导几率的可能途径,为转化困难的植物的基因工程操作奠定基础。LBD (laterial organ boundaries domain)家族基因、伤口诱导脱分化蛋白WIND1 (wound induced dedifferentiation 1)、AP2/ERF转录因子BABYBOOM等参与了植物胚性愈伤诱导的过程;DNA甲基化在这个过程中也发挥了重要作用,植物胚性细胞通过PCG和PKL通路两种表观遗传途径促使胚性细胞保持胚性。这些研究结果表明,通过筛选距离合子胚最近的体细胞作为外植体,利用分子标记进行筛选具有胚性的细胞或组织作为外植体进行培养,在培养基中添加去甲基化的试剂等方法可能能够提高植物胚性愈伤诱导的比例,转化困难的农作物的基因工程育种有望得到显著改进。     

柑橘愈伤组织倍性变化及其与体细胞胚胎发生能力的关系

柑橘愈伤组织是细胞融合、遗传转化等生物技术研究的良好材料。本实验室通过近20年的工作,先后诱导和保存了近80份不同种类和品种的柑橘愈伤组织。这些愈伤组织在MT基本培养基上继代保存。在长期保存过程中,部分材料仍然保持较好的胚胎发生能力。为研究愈伤组织在继代过程中的染色体变异趋势以及这种变异对胚胎发生能力的影响,本文选择有代表性的35份材料作为试材,在4年中连续3次使用流式细胞仪,对细胞DNA含量进行测定。结果发现,待测的35种愈伤组织均存在部分细胞DNA含量加倍的现象,而且,随着时间的推移,除佩奇橘柚、沙漠蒂甜橙、鲁斯脐橙、印度酸橘等4种愈伤组织的DNA含量加倍的细胞有减少的趋势外,其他愈伤组织的DNA含量加倍的细胞均有增加的趋势。数据分析表明,在待测的35种愈伤组织中,有71．4％的基因型的愈伤组织细胞出现了多倍体细胞增加的趋势。对这35种柑橘愈伤组织进行体细胞胚诱导,发现只有9种愈伤组织具有不同程度的胚胎发生能力,其他26种愈伤组织不能再生。相关性分析表明,柑橘愈伤组织细胞DNA含量增加的细胞比例与体细胞胚胎发生能力之间的相关性较小,相关系数为忙-0．10（P〈0．01）,未达到显著水平。另外,柑橘胚性愈伤组织继代时间与体细胞胚胎发生能力之间的相关性也不显著。     

伏令夏橙愈伤组织体细胞胚发生中多胺水平的变化

以继代培养8年的伏令夏橙愈伤组织为材料,研究了不同类型愈伤组织体细胞胚发生能力的差异和多胺水平的变化及两者之间的关系.结果表明,胚性愈伤组织的多胺含量高于非胚性愈伤组织,体细胞胚发生能力与多胺水平呈正相关.体细胞胚发生早期Put含量的增加有利于体细胞胚发生.球形胚大量形成时,Spd达到最高值;球形胚发育后期并有少量心形胚形成时Spm达到峰值.随着倍性的增加,伏令夏橙体细胞胚发生能力降低.精氨酸脱羧酶的活性变化与Put水平呈正相关,表明它是调节伏令夏橙体细胞胚发生中多胺水平的重要因子.     

楸树体细胞胚胎发生过程中4种同工酶分析

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对楸树体细胞胚胎发生过程中的酯酶(EST)、过氧化物酶(POD)、淀粉酶(AMY)及ATP酶4种同工酶进行分析。结果表明,EST及POD同工酶酶带在楸树体细胞胚胎发生不同时期呈现规律性变化,胚性愈伤组织中EST、POD同工酶酶带较非胚性愈伤组织多且表达活跃,子叶胚时期活性最强,表明这一时期细胞内代谢旺盛。EST、POD、AMY及ATP同工酶在楸树胚性与非胚性愈伤组织中谱带差异明显,表明这4种同工酶与体胚发生具有密切关系,可以作为楸树胚性愈伤组织和体胚发生的重要标志。     

Genetic and epigenetic stability of cryopreserved and cold-stored hops (Humulus lupulus L.)

Conventional cold storage and cryopreservation methods for hops (Humulus lupulus L.) are available but, to our knowledge, the genetic and epigenetic stability of the recovered plants have not been tested. This study analyzed 51 accessions of hop using the molecular techniques, Random Amplified DNA Polymorphism (RAPD) and Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), revealing no genetic variation among greenhouse-grown controls and cold stored or cryopreserved plants. Epigenetic stability was evaluated using Methylation Sensitive Amplified Polymorphism (MSAP). Over 36% of the loci were polymorphic when the cold and cryo-treated plants were compared to greenhouse plants. The main changes were demethylation events and they were common to the cryopreserved and cold stored plants indicating the possible effect of the in vitro establishment process, an essential step in both protocols. Protocol-specific methylation patterns were also detected indicating that both methods produced epigenetic changes in plants following cold storage and cryopreservation.     

甘露醇对拟南芥基因组DNA甲基化的影响

以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料,研究不同浓度甘露醇处理下拟南芥幼苗生长发育及其基因组DNA的甲基化水平和变化模式。结果表明,用50、100、150和200mmol·L―1甘露醇处理拟南芥种子会对拟南芥幼苗的形态特征和生长态势产生影响;甲基化敏感扩增多态性（methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP）分析表明,经50、100、150和200mmol·L―1甘露醇处理后,基因组DNA甲基化比率分别为17.75%、21.15%、15.49%和46.10%。甘露醇处理使拟南芥发生基于DNA甲基化水平和模式改变的表观遗传变异。与对照相比,在50、100、150和200mmol·L-1甘露醇处理下拟南芥幼苗基因组DNA的甲基化和去甲基化比率分别为5.78%、15.48%、10.71%、33.73%及10.98%、5.36%、8.33%、7.69%。由此推测,5-甲基胞嘧啶百分含量随着甘露醇胁迫的增强而发生不同程度的变化。     

不同倍性西瓜基因组DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一,在基因表达调控中发挥重要作用。本研究以不同倍性（2x、3x、4x）西瓜为试材,采用基于DNA甲基化敏感酶的扩增多态性分析（Methylation-Sensitive Ampliftcation Polymorphism,MSAP）方法,在全基因组水平上探究西瓜同源多倍化过程中DNA序列中CCGG位点的甲基化水平及模式变化特征。研究中选用23对选扩引物,共检测到1883个基因位点。二倍体、三倍体、四倍体中检测到的位点数分别为647、655和581;其中发生甲基化的位点数分别为181、150和159。相应的扩增总甲基化率分别为28．0％、22．9％和27．4％：全甲基化位点数分别为121、80和82,相应的全甲基化率分别为18．7％、12．2％和14．1％。进一步对不同倍性西瓜DNA甲基化模式的变化特征进行分析,结果显示：四倍体西瓜与二倍体西瓜相比有超过半数的位点（54．4％）DNA甲基化模式发生了变化,其与三倍体西瓜相比也有近一半的位点（45．4％）DNA甲基化模式发生了变化,并且变化趋势都以四倍体西瓜甲基化程度升高为主：而三倍体西瓜与二倍体西瓜相比．虽然也有41．6％的位点DNA甲基化模式发生了改变,但变化趋势以三倍体西瓜甲基化程度降低略占优势：与之相似,三倍体西瓜与四倍体相比较。甲基化的变化趋势也是以三倍体西瓜甲基化程度降低为主。以上结果表明：不同倍性西瓜中DNA甲基化事件虽均有发生．但不论是从总甲基化率还是全甲基化率来看,DNA甲基化水平与倍性高低关系不大．三倍体西瓜表现出较为显著的低甲基化水平特征。DNA甲基化模式的分析也表明。与二倍体及四倍体西瓜相比．三倍体西瓜DNA甲基化模式的调整主要以去甲基化为主。显示出三倍体西瓜基因组独特的DNA甲基化特征。本研究为进一步从表观遗传学的角度探讨西瓜的三倍体优?     

不同生理年龄毛竹DNA甲基化的MSAP分析

为分析竹子年龄变化与基因组DNA甲基化之间的相关性,以5年、31年和>60年起源(从种子萌发年龄算起)的毛竹当年生叶片为材料,采用35对引物对其进行MSAP检测。结果表明:3个年龄段的总甲基化率和全甲基化率分别为24.44%、28.21%、32.12%和16.57%、19.41%、21.23%;发生DNA甲基化的变异位点为52.3%,去甲基化变异位点为10.3%。可以看出,随着年龄的增加,毛竹基因组DNA甲基化敏感多态性呈上升趋势。总甲基化率单因素方差分析的结果表明相同年龄的毛竹个体间没有差异(P=0.307>0.05),而不同年龄间的差异达极显著水平(P<0.001)。同时,对所用引物组合进行分析后发现有6对引物(E3/HM2、E3/HM6、E3/HM7、E4/HM5、E4/HM6和E5/HM5)扩增出的位点与总趋势显著相关,为进一步开展深入研究奠定基础。     

应用MSAP方法检测鸡不同组织基因组的甲基化状态

以白洛克肉鸡和白来航蛋鸡及其杂交F1代基因组为实验材料,应用甲基敏感扩增片段多态性方法(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)检测了鸡肌肉、心脏、肝脏和肾脏4个不同组织基因组在CCGG位点的甲基化状态,分析了不同组织的DNA甲基化水平及组织特异性甲基化模式。研究发现:肌肉组织的甲基化水平约为29.7%,肝脏组织约为27.5%,心脏组织约为27.5%,肾脏组织约为26.1%;在鸡3个不同群体及其中3个不同组织间,基因组甲基化程度差异显著(P<0.05);在检测的4个组织中,CCGG序列的全甲基化位点少于半甲基化位点,与植物的相关研究不一致;分离及鉴定了2个组织特异的甲基化片段。结果表明:鸡不同组织基因组的甲基化状态是不同的,同一组织的甲基化水平在不同的群体是不同的,而不同组织甲基化水平的排序在不同的群体是不一致的。这些结果揭示遗传效应可能影响个体的组织甲基化水平。     

低剂量重离子辐射对水稻种子和幼苗DNA甲基化的影响

为了研究低剂量重离子辐射对植物产生的表观遗传学效应,采用高传能线密度（62．2keV／μm）和低剂量（2Gy）的放射性束流^12C对水稻（Oryzasativa,japonica）的干种子和幼苗进行辐射。采用甲基化敏感限制性酶切多态性分析（MSAP）的方法对材料基因组CCGG位点的甲基化状态进行检测。共选用12对选择性引物扩增了共800个条带,其中有65个条带（8．13％）在种子辐射后发现呈多态性,而只有10个条带（1．3％）在幼苗辐射后发现呈多态性。统计学分析显示高能量低剂量的重离子对水稻种子和幼苗的基因组甲基化状态都产生了影响,而且种子受到辐射后产生的甲基化改变明显高于幼苗（P=0．011）。另外,甲基化和去甲基化变化类型的分析也表明种子和幼苗辐射后发生甲基化变化的趋势也不相同。     

单链DNA纯化对变性PAGE凝胶银染片段回收效率的提高

为了提高变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）银染后片段回收的效率,本实验在传统的煮沸法的基础上加入单链DNA纯化的步骤对水稻基因组CCGG为点甲基化敏感限制性酶切多态性（MSAP）分析片段进行回收,并对加入该步骤后的再扩增的效率与传统煮沸法进行了比较。实验结果显示,加入单链DNA纯化步骤后的回收效率比传统煮沸法提高了约6倍。改进后的方法可以有效地用于扩增片段长度多态性（AFLP）以及MSAP等差异显示PAGE凝胶银染DNA片段的回收。     

喜旱莲子草MSAP分析技术反应体系的建立

目的：建立一个适于研究喜旱莲子草DNA甲基化的MSAP分析体系。方法：以喜旱莲子草为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,并对影响MSAP分析的关键步骤包括基因组DNA酶切反应时间、模板DNA连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等进行了优化。结果：改良CTAB方法提取的DNA质量较好,酶切反应时间5h,酶切连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩产物稀释10倍进行选择性扩增,所得PCR产物经6%聚丙烯酰胺电泳,条带清晰可辨,并能有效检测喜旱莲子草基因组DNA甲基化的程度和状态。结论：为研究喜旱莲子草表观遗传适应机制奠定了基础。     

长白猪×蓝塘猪及其杂种基因组甲基化片段克隆与分析

应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对6头长白公猪和50头蓝塘母猪及5头长白×蓝塘杂交F1代3个群体基因组DNA胞嘧啶甲基化位点进行检测,旨在克隆和分析父母代猪及其杂种F1代之间基因组DNA共同甲基化片段和差异片段,并找到其同源基因.结果显示,从MSAP条带中分离、克隆得到18条3个群体共同的甲基化片段、10条母代独有的甲基化片段和9条杂交一代独有的甲基化片段,其中有1条3个群体共有的甲基化片段通过EST拼接和电子延伸后在NCBI数据库中找到同源基因,即猪类酪氨酸蛋白激酶Lyn基因(GeneID:LOC100152890,序列号:XM_001926250).结果表明,长蓝杂交F1代与其父母代之间的基因组甲基化存在异同,为通过MSAP技术克隆猪基因组DNA甲基化片段及寻找其对应的甲基化基因提供可能,也会为将来研究这些甲基化基因表达调控机制奠定基础.