青枯菌诱导的花生基因表达谱SSH分析

以抗青枯病花生种质‘J4’和‘中花6号’、感青枯病花生品种‘中花12号’为材料,用强产青枯菌毒菌株(Ralstonia solanacearum)对其根系分别接种,采用抑制差减杂交(SSH)技术检测花生根系应答侵染的基因表达谱变化,并对文库中差异基因进行Real-time PCR分析。结果表明:经菌液PCR检测对挑选出的1 036阳性克隆片段进行测序及片段整合分析,获得162条花生基因,有功能注释的基因58条,其中44条基因参与了细胞结构(6%)、信号转导(12%)、抗病防御(5%)、转录调控(12%)等生理过程。用Real-time PCR技术对7个基因在‘中花6号’和‘中花12号’中的表达模式分析结果表明,6个基因在青枯菌侵染早期在抗病材料‘中花6号’中呈上调表达,可能与青枯病抗性直接相关。     

基于cDNA-AFLP技术的玉米种子劣变相关基因分析

以人工控制劣变处理（温度45℃,相对湿度100%）3 d的玉米杂交种‘郑单958’种子为材料,通过cDNA-AFLP技术,共获得约5 400个转录本。对差异片段进行测序分析,最终获得122个种子劣变相关基因序列（DRS）,其中,上调表达74个,下调表达48个,功能涉及初生代谢、次生代谢、蛋白代谢、转录与调控、胁迫响应、信号转导和运输。采用qRT-PCR技术分析了11个上调表达差异基因的表达模式,结果显示不同基因的表达模式存在较大差异,说明不同基因在种子劣变中可能扮演不同角色。     

青枯病病菌对茄子相关防卫信号基因表达及活性氧含量的影响

本文以茄子抗青枯病自交系和感病自交系为试材,在接种青枯病菌后,对调控抗性反应的不同信号传导基因进行表达特性分析。结果表明,在9个基因中,EDS1、PAD4、NPR1、SGTI和WRYK70等5个基因的表达均随着接种诱导时间延长而增加,而且在抗病自交系‘E-31’中的表达量要高于感病自交系‘E．32’;而JAR1、NDR1、EIN2YeaRARl等基因的表达随着接种诱导时间的增加,表达水平变化不大。初步推断EDS1、PAD4、NPRI、SGTI和WRYK70可能与调节茄子抗青枯病抗性反应有关。同时茄子在接种后活性氧的含量均增加,但是感病植株的含量高于抗病植株。     

基于cDNA-AFLP及MSAP技术分析西瓜同源二倍体和四倍体低温胁迫差异表达

为了研究西瓜二倍体及同源四倍体在低温胁迫下的分子机制,以西瓜‘京欣’1号母本83166（二倍体）及其同源四倍体为材料,利用MSAP及cDNA-AFLP技术研究低温处理前后基因表达的差异,并对差异带进行克隆、测序和比对。22对MSAP引物扩增得到1564个位点,其中二倍体经低温处理后总甲基化率下降2.8%,四倍体下降6.4%。将12条差异带与西瓜基因组数据库比对,有7条带确定是西瓜基因组序列。26对cDNA-AFLP引物组合扩增出1267条带,其中二倍体上调表达占48.2%,下调表达占51.8%;四倍体上调表达占58.6%,下调表达占41.4%。23条差异带在NCBI中找到了同源序列基因,包括假定蛋白（39.13%）、能量与代谢（43.48%）、物质运输（8.70%）、转录相关（4.35%）以及逆境相关（4.35%）,另有10条无同源序列。低温胁迫后,四倍体去甲基化率与上调表达量均高于二倍体,而且四倍体诱导出的差异基因参与了物质的能量代谢调控及逆境胁迫过程,说明四倍体较二倍体有更强的耐冷性。     

番茄青枯病抗性相关miRNA的鉴定与表达分析

为理解番茄（Solanum lycopersicum）青枯病抗性响应miRNA与靶基因间的调控关系,对抗、感番茄自交系接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）前后进行小RNA测序。结果在8个样本中共获得112.76 M高质量数据,检测到336个miRNA,包括193个新miRNA。其中,31个差异表达miRNA靶向调节575个基因的表达。556个靶基因被注释到防御反应、植病互作、植物激素信号转导等代谢途径中。启动子除典型的转录起始TATA-box和CAAT-box,及与生物胁迫相关的W-box和TC-rich repeats,还存在激素、光、非生物胁迫、伤等响应元件。RT-qPCR验证发现6对mi RNA-targets具有正-负、负-正和负-负3种番茄青枯病应答模式。这些结果初步揭示miRNA可以通过靶向基因表达响应番茄青枯病。     

棉花细胞核雄性不育两用系差异表达基因分析

应用cDNA-AFLP对棉花ms5ms6双隐性核雄性不育两用系的不育株和可育株花粉发育的3个时期—造孢细胞时期、花粉母细胞时期和花粉粒时期进行对比分析,共得到17个差异表达片段,它们分别属于11种表达模式,其中14个片段可以在NCBI数据库中找到同源序列,功能分析表明这些片段所编码的基因可能参与了信号转导、转录、能量代谢、细胞壁发育等相关过程。Northern杂交结果证明检测片段的表达模式与cDNA-AFLP结果吻合。同时还在可育花药中发现了与玉米T型细胞质雄性不育恢复因子RF2基因高度同源的育性恢复因子类基因。     

芍药种子下胚轴休眠相关基因的cDNA-AFLP分析

旨在探讨芍药种子下胚轴的休眠机理,采用cDNA-AFLP技术对层积0 d和根部露白两个时期的芍药种子进行基因差异表达分析。利用256对引物组合进行扩增,筛选获得3 600个差异表达转录衍生片段(TDFs),成功回收到1 200个TDFs,选取500个TDFs对其克隆测序,共得到42个有效序列。经BLAST比对发现,其中30个TDFs与已知功能基因同源,分别参与芍药种子下胚轴休眠过程中的基因表达调控、信号转导、逆境胁迫、物质与能量代谢等过程,9个TDFs与功能未知基因及假想蛋白同源,另有3个TDFs为无同源序列,可能是新的未知基因,这些基因有助于更好地阐明芍药种子下胚轴休眠机理。     

用SSR和AFLP技术分析花生抗青枯病种质遗传多样性的比较

由Ralstonia solanacearum E.F.Smith引起的青枯病是若干亚洲和非洲国家花生生产的重要限制因子,利用抗病品种是防治这一病害最好的措施。虽然一大批抗青枯病花生种质资源材料已被鉴定出来,但对其遗传多样性没有足够的研究,限制了在育种中的有效利用。本研究以31份对青枯病具有不同抗性的栽培种花生种质为材料,通过简单序列重复(SSR)和扩增片段长度多态性(AFLP)技术分析了它们的遗传多样性。通过78对SSR引物和126对AFLP引物的鉴定,筛选出能显示抗青枯病种质多态性的SSR引物29对和AFLP引物32对。所选用的29对多态性SSR引物共扩增91条多态性带,平均每对引物扩增3.14条多态性带;32对多态性AFLP引物共扩增72条多态性带,平均扩增2.25条多态性带。在所筛选引物中,4对SSR引物(14H06,7G02,3A8,16C6)和1对AFLP引物(P1M62)检测花生多态性的效果优于其他引物。SSR分析获得的31个花生种质的遗传距离为0.12-0.94,平均为0.53,而AFLP分析获得的遗传距离为0.06～0.57,平均为0.25,基于SSR分析的遗传距离大于基于AFLP分析的遗传距离,疏枝亚种组的遗传分化相对大于密枝亚种组。基于两种分析方法所获得的聚类结果基本一致,但SSR数据聚类结果与栽培种花生的形态分类系统更为吻合。根据分析结果,对构建青枯病抗性遗传图谱群体的核心亲本和抗性育种策略提出了建议。     

茶树冷诱导基因的AFLP筛选及其表达分析

以中小叶茶树良种舒茶早和云南大叶种73-11为材料,于4℃低温处理4 d后,采用AFLP技术筛选出冷诱导下茶树差异表达基因并进行分析.结果显示,实验共获得41个差异片段(TDFs),其中舒茶早产生19条差异条带,73-11产生38条差异条带,两品种共有条带16条.所获得的差异片段按功能可划分为4类,即信号传导蛋白、转录因子、基础代谢相关蛋白、抗逆蛋白质,此外还有一些假设蛋白质以及未知蛋白.利用qRT-PCR对Kh1、Kh3和Kh11差异片段进行验证,结果显示这3个片段均被低温诱导,表达量上升.研究表明,茶树在低温胁迫下的逆境反应非常复杂,涉及多种代谢过程中的众多基因,而且大叶种比中小叶种对低温反应更为敏感.     

油菜种子发育和萌发过程中脱水耐性相关基因的cDNA-AFLP分析

选取甘蓝型油菜种子发育和萌发过程中与脱水耐性相关的不同时间点,采用cDNA-AFLP技术通过128对引物组合分析,共获得394条特异转录衍生片段(TDFs)。经BLAST序列比对,发现其中189条与GenBank数据库中已知功能基因同源,按其功能可分为转录因子、基础代谢、抗逆胁迫、信号转导等相关蛋白。RT-PCR技术对差异显著性片段验证结果显示,泛素蛋白、油体蛋白、热激蛋白和一些转录因子片段均受到种子脱水诱导表达。研究结果表明,发生在种子发育和萌发过程中的脱水耐性反应非常复杂,涉及植物生命活动的诸多领域。     

Transcriptomic and Proteomic Analyses of Resistant Host Responses in Arachis diogoi Challenged with Late Leaf Spot Pathogen,Phaeoisariopsis personata

Late leaf spot is a serious disease of peanut caused by the imperfect fungus, Phaeoisariopsis personata. Wild diploid species, Arachis diogoi. is reported to be highly resistant to this disease and asymptomatic. The objective of this study is to investigate the molecular responses of the wild peanut challenged with the late leaf spot pathogen using cDNA-AFLP and 2D proteomic study. A total of 233 reliable, differentially expressed genes were identified in Arachis diogoi. About one third of the TDFs exhibit no significant similarity with the known sequences in the data bases. Expressed sequence tag data showed that the characterized genes are involved in conferring resistance in the wild peanut to the pathogen challenge. Several genes for proteins involved in cell wall strengthening, hypersensitive cell death and resistance related proteins have been identified. Genes identified for other proteins appear to function in metabolism, signal transduction and defence. Nineteen TDFs based on the homology analysis of genes associated with defence, signal transduction and metabolism were further validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) analyses in resistant wild species in comparison with a susceptible peanut genotype in time course experiments. The proteins corresponding to six TDFs were differentially expressed at protein level also. Differentially expressed TDFs and proteins in wild peanut indicate its defence mechanism upon pathogen challenge and provide initial breakthrough of genes possibly involved in recognition events and early signalling responses to combat the pathogen through subsequent development of resistivity. This is the first attempt to elucidate the molecular basis of the response of the resistant genotype to the late leaf spot pathogen, and its defence mechanism.