四甲基氯化铵在PCR扩增小麦基因中的关键作用

利用高简并性引物,用PCR法从小麦DNA或cDNA中合成小麦几丁质酶基因、葡 聚糖酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因片段。在PCR反应中添加四甲基氯化铵(TMACl)是合成这些特异基因片段的关键。合成的PCR片段都经末端补齐和磷酸化后用于克隆。核酸序列分析证实,这些PCR产物分别与用于设计PCR引物的基因具有高度的同源性。 Abstract:In the presence of tetramethy1 ammonium chloride(TMAC1),a chitinase gene sequence,a phenylalanine ammonia-lyase gene sequence and a glucanase cDNA sequence of wheat were amplified with highly degenerate primers by PCR.The inclusion of TMAC1 in the PCR reactions was essential for successful amplification of the desired sequences from genomic DNA or cDNA in wheat.The ends of the PCR fragments were made flush and phosphorylated prior to cloning.Sequence analyses of the above PCR fragments confirmed their identities,showing high sequence similarities to the genes used for the design of PCR primers.     

两个紧密连锁的小麦苯丙氨酸解氨酶基因的分离与鉴定

利用一个小麦苯丙氨酸解氨酶基因PCR片段为探针,从小麦核DNA基因库中筛选出一个阳性噬菌体克隆,该克隆含有两个高度同源、紧密连锁、转录方向相同的小麦苯丙氨酸解氨酶基因PAL1与PAL2,它们之间的核酸序列同源性。为93％,相距约7kb,利用PAL1特异片段进行Southern分析,表明该基因在小麦基因组中具有多个拷贝。Northern杂交表明,经秆锈菌接种诱导,苯丙氨酸解氨酶基因在一对小麦抗-感近等基因系中差异表达：抗病等基因系中国春-Sr11携带与接种菌无毒性基因P11相对应的抗病基因Sr11,在接种4d后开始诱导表达,8d后表达量更高;而缺少抗病基因的感病系中国春-sr11接种6d后才开始表达,8d后的表达量与抗病系中6d时相当。用秆锈菌诱导物和几丁质寡聚物处理小麦悬浮细胞,均可在2h内激活苯丙氨酸解氨酶基因表达,但真菌诱导物在早期的诱导活性显著高于几丁质寡聚物。从转录水平证实了小麦苯丙氨酸解氨酶基因在秆锈菌诱导的抗性反应中具有重要作用。     

山葡萄几丁质酶基因VCH3启动子的分离及鉴定

利用接头PCR技术首次分离了长度为1 216bp的"双优"山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)classⅢ几丁质酶基因VCH3上游启动子序列(GenBank登录号AF441123),并用引物延伸方法鉴定了该启动子的转录起始位点,为5'-ATCAAGCAC-31序列中的第二个A.序列分析结果表明,代表真核基因启动子特征的CAAT盒和TATA盒分别位于VCH3启动子转录起始位点上游-122和-29处.另外,在转录起始位点上游-1 181 bp和-293 bp处各有一个水杨酸(SA)响应的顺式作用元件TGACG.为了鉴定该启动子的功能,将该启动子连接到β-葡糖苷酸酶基因(GUS)编码区的上游构建了VCH3启动子-GUS融合基因,并用农杆菌介导叶盘转化法将该融合基因转入烟草栽培品种NC89中.SA处理的转基因烟草根系和叶片GUS酶活性的荧光和组织化学检测结果表明VCH3启动子的驱动作用被SA诱导,因而该启动子在基因工程中将具有潜在的应用价值.     

利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除的初步研究

对利用基因诱捕技术进行小鼠基因剔除做了初步的探索,为进一步应用该技术进行小鼠基因功能研究奠定了基础.利用基因诱捕载体转染小鼠ES细胞,获得了36株neo基因单拷贝整合的诱捕ES细胞,其中14株细胞表达有活性的β半乳糖苷酶.将3株诱捕ES细胞分别经显微注射引入到受体囊胚中,再植入假孕母鼠的子宫中使其发育成小鼠.两株细胞得到了程度不同的嵌合体小鼠,其中一株诱捕ES细胞整合至生殖系.利用质粒拯救实验获得了诱捕载体整合位点附近的基因组序列,通过序列比对发现被诱捕的基因可能是一个新基因.X-gal染色结果显示,该基因的表达局限于小鼠腹部及肢芽的部位.     

p35Nck5a基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复,采用常规的分子克隆技术,构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞,经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择,获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆,细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复,同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。     

Identification of a Saxitoxin Biosynthesis Gene with a History of Frequent Horizontal Gene Transfers

The paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins, saxitoxin, and its derivatives, are produced by a complex and unique biosynthetic pathway. It involves reactions that are rare in other metabolic pathways, however, distantly related organisms, such as dinoflagellates and cyanobacteria, produce these toxins by an identical pathway. Speculative explanations for the unusual phylogenetic distribution of this metabolic pathway have been proposed, including a polyphyletic origin, the involvement of symbiotic bacteria, and horizontal gene transfer. This study describes for the first time the identity of one gene, sxt1, that is involved in the biosynthesis of saxitoxin in cyanobacteria. It encoded an O-carbamoyltransferase (OCTASE) that was proposed to carbamoylate the hydroxymethyl side chain of saxitoxin precursor. Orthologues of sxt1 were exclusively present in PSP-toxic strains of cyanobacteria and had a high sequence similarity to each other. L. wollei had a naturally mutated sxt1 gene that encoded an inactive enzyme, and was incapable of producing carbamoylated PSP-toxin analogues, supporting the proposed function of Sxt1. Phylogenetic analysis revealed that OCATSE genes were present exclusively in prokaryotic organisms and were characterized by a high rate of horizontal gene transfer. OCTASE has most likely evolved from an ancestral O-sialoglycoprotein endopeptidase from proteobacteria, whereas the most likely phylogenetic origin of sxt1 was an ancestral alpha-proteobacterium. The phylogeny of sxt1 suggested that the entire set of genes required for saxitoxin biosynthesis may spread by horizontal gene transfer.     

基因打靶技术:开启遗传学新纪元

基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标的过程中发挥着重要的作用。近年来, 随着条件基因打靶技术的发展使基因失活可以限制在特定时段特定组织或细胞内。文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在其他模式动物中的应用。     

类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程

类胡萝卜素具有多种生物功能,尤其在保护人类健康方面起着重要的作用,如它们是合成维生素A的前体,能够增强人体免疫力和具有防癌抗癌的功效。人体自身不能合成类胡萝卜素,必须通过外界摄入;但类胡萝卜素在许多植物中含量较低,并且很难用化学方法合成。随着类胡萝卜素生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆,运用基因工程手段调控类胡萝卜素的生物合成已成为可能。本文综述了微生物和高等植物类胡萝卜素生物合成途径中相关基因的克隆,以及运用这些基因通过异源微生物生产类胡萝卜素和提高作物类胡萝卜素含量的基因工程研究进展。     

RNA干涉在基因治疗中的应用

RNA干涉(RNA interference,RNAi)是一种可以在细胞内抑制特定基因表达的现象.它由双链RNA产生,可以特异性地降解具有相同或者相似序列的RNA（包括mRNA）.它是一种比反义技术更为有效的方法,具有更高的特异性,逐渐成为研究者关注的焦点.人们已经开始探讨使RNA干涉成为一种比反义药物更为有效药物的可能性及其具体的实施方案, 但是也发现它在成为一种安全有效治疗手段之前还有很长的一段路要走.将从RNA干涉的基本理论入手,分析目前这项技术在治疗研究中的应用以及可能遇到的一些问题.     

杆状病毒p74基因具有种属特异性

选用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒杆粒 (AcMNPVbacmid)为材料 ,通过在大肠杆菌中利用RecA基因介导的同源重组 ,将其p74基因剔除 ,并精确地用斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)的p74基因进行了替换。所构建的重组AcMNPV杆粒在修饰后的p74基因位点中未留下任何有可能影响该基因表达及功能的选择标记 ,SpltMNPV的p74基因直接位于AcMNPVp74基因的启动子控制下。RT PCR显示替换后的p74基因得到了表达。生物测定结果显示 ,重组病毒AcMNPV杆粒 polhSL74无法通过口服方式感染银纹夜蛾幼虫 ,表明杆状病毒p74基因具有种属特异性。     

一个人类新基因ZNF322的研究初报

利用果蝇心脏发育基因zfh-1的cDNA序列和计算机克隆方法,在9号染色体上发现了一个新的人类同源基因,经国际基因全程委员会批准,命名为ZNF322。该基因总长度约为2.8kb,为一个连续的序列,编码一个402个氨基酸的蛋白质,与小鼠zfp-25编码的蛋白质最相似（同源度为51.4%）。该基因在人体肾、脑、结肠、胚胎心脏及黑色素瘤等多种组织中广泛表达,其功能有等深入研究。     

肝癌基因调控网络研究进展

肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一。肝癌基因调控网络(HCC regulatory network,HCC GRN)是研究肝癌分子机制的重要途径之一,其节点包括肝癌相关的分子,如mi RNA、TF等,网络的边由节点间相互作用关系构成。基于不同类型的数据构建的肝癌基因调控网络其类型及特征各有不同。综合近年来肝癌基因调控网络研究发现,由TF与mi RNA构建的肝癌转录调控网络更能揭露肝癌关键基因,反映关键基因在调控网络中的扰动情况。整合基因变异信息与调控网络成为研究肝癌基因调控网络的趋势,但相应的研究几乎是空白的。本文从HCC GRN的数据来源、分类及特征,及各类型调控网络的近年研究情况等方面进行综述,并结合相关研究工作对肝癌基因调控网络研究现状进行分析与讨论,对前景进行展望,为这一领域研究工作提供参考。