水稻 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基 I 基因的启动子分析

水稻（Oryce sativa L．）基因组中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基（ADP-Glucose pyrophosphorylase small subunit,OsAgpS）由两个基因编码,即OsAgpSl和OsAgpS2。其中OsAgpSl基因产生两个转录本OsAgpSla和OsAgpSlb,区别在第一个外显子的位置不同。通过RT—PCR方法分析了两个转录本在水稻组织和胚乳不同发育时期的表达特性;同时通过报告基因GUS检测了两个转录本上游转录调节区DNA片段的转录启动特性。结果表明,两个启动子与其下游转录本的表达模式完全一致,即OsAgpSla转录本和OsAgpSla上游启动子控制的GUS基因主要在胚乳中高水平表达,在叶片中有很低水平的表达;而OsAgpSlb转录本和OsAgpSlb上游启动子控制的GUS基因主要在叶片和胚乳发育早期低水平表达。这说明OsAgpSl基因产生的两个转录本是由不同的启动子控制转录的,OsAgpSla上游启动子可以作为胚乳表达用启动子。     

参与水稻光合作用的PsbR3基因启动子的功能分析

本实验旨在研究水稻光合作用蛋白中各基因的表达模式. 采用RT-PCR和定量real-time PCR数据分析水稻不同组织的mRNA表达水平.结果显示,PsaK和PsbR3基因仅在茎、叶等绿色组织表达,而胚、胚乳部分均不表达.通过其启动子克隆、植物表达载体构建,以及农杆菌介导转化后,GUS组织染化分析和GUS荧光定量分析表明,两启动子均为组织特异性优势表达,PsbR3启动报告酶GUS在叶片中的表达活性为Actin启动子的3.29倍,而PsaK启动报告酶GUS在叶片中的表达活性低于Actin启动子的.这些初步结果提示,PsbR3启动子决定水稻绿色组织茎叶的优势表达,PsbR3基因可能参与水稻光合作用.     

水稻种子醇溶蛋白4a基因的表达受串联复合启动子调控

从水稻中花8号中克隆了醇溶蛋白4a的基因5＇侧翼区并首次报道该基因5＇端-680～-18区段具有胚乳特异性表达调控功能.本研究通过 5’缺失方法对该基因5＇侧翼区的结构和功能进行了进一步分析,结果表明:(1)醇溶蛋白4a基因启动子Ⅰ能够特定地在转基因烟草开花发育 22 d后的种子胚乳中激活下游 GUS融合基因表达,是该基因有功能的启动子;(2)prolamin box Ⅱ对该基因的表达具有增强功能;(3)启动子Ⅰ的转录起始点是位于该基因起始ATG上游63 bp处的C碱基.     

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中EST丰度,从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Os772和Os359,并将启动子片段与GUS报告基因融合,构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经GUS组织化学分析显示,Os772和Os359能启动GUS基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Os772和Os359为两个水稻胚乳特异性启动子。     

一个水稻高效表达启动子Os252的分离

植物基因的表达受启动子的控制,高效表达启动子的分离及功能分析不仅是植物基因工程研究的重要研究方面,也是表达调控研究的重要内容。根据EST数据克隆了一个预测在水稻茎中高效表达的启动子Os252。将该启动子与GUS基因构建成表达载体并转入水稻。转基因水稻PCR分析表明,GUS基因已经成功地整合进水稻基因组中。GUS组织化学分析表明,Os252能启动GUS基因在水稻叶、茎以及胚乳中表达。进一步GUS酶活性的测定表明,叶和胚乳中Os252启动子活性分别是35S启动子的1.9和2.5倍。由于Os252来自于水稻,在叶和胚乳中活性高于35S启动子,因此该启动子可望用于水稻基因工程研究。     

水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达

为将不同启动子用于转基因水稻的研究,从武运粳8号水稻中克隆了Rubisco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区,构建了由rbcS启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞中特异性高效表达,而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织与细胞特异性.结果还表明,光诱导处理可明显提高rbcS启动子启动的外源基因的表达量.     

水稻OsGSTL1启动子的分离和表达分析

从水稻基因组文库中筛选得到一个水稻GST基因,命名为OsGSTL1.半定量RT-PCR分析表明OsGSTL1基因的表达不受绿磺隆、乙烯利、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯的诱导,因此该基因可能与植物抗逆性无关.为了研究OsGSTL1启动子在植物体内的表达特性,将OsGSTL1起始位点5＇端上游不同长度的调控序列与报告基因GUS融合,并在洋葱表皮瞬间表达和拟南芥中稳定表达.研究表明：在洋葱表皮细胞中,160bp及更长的上游调控序列均能启动GUS基因的表达;而在转基因拟南芥中,含有2155 bp的上游序列的PGZ2.1：：GUS具有时空表达的特性,在转基因的早期幼苗中GUS基因在子叶中特异性表达,但在根中没有表达;而在幼苗生长的后期,根、茎、叶中都有少量的表达.但包含1 224 bp的上游序列的PGZ1.2：：GUS却表现为组成型表达的特性.由此推测,OsGSTL1启动子启动的基因表达可能与幼苗的营养代谢相关;而OsGSTL1启动子的时空表达相关元件可能位于OsGSTL1翻译起始位点5＇端上游-2155 bp至-1224 bp范围内.     

水稻OsNRT1-d启动子的分离和功能分析

采用PCR技术,从水稻基因组中分离到OsNRT1-d读码框上游2 019 bp序列.序列分析表明:在起始密码ATG上游-189 bp和-127 bp处分别存在CAAT-box和TATA-box,具有典型的启动子结构.推测的转录起始位点CAC位于起始密码ATG上游-93 bp处.将OsNRT1-d启动子5′-端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得的NRT2019∷GUS、NRT1196∷GUS 和NRT719∷GUS转基因载体.农杆菌介导转化水稻,获得的转基因水稻均能启动下游GUS报告基因在水稻的根、叶、花颖和种子中表达;将转基因水稻幼苗放在滤纸上紧急干旱处理和用15% PEG6000进行模拟干旱处理,GUS基因的表达量明显升高,且干旱应答元件在-719 bp～-1 bp的范围内;GUS活性分析表明:OsNRT1-d启动子对ABA、NaCl、(NH4)2SO4、KNO3和Gln等信号没有应答反应.     

木薯可溶性淀粉合成酶(MeSSⅡb)启动子克隆及梯度缺失分析

木薯淀粉被广泛用作各种食品、饲料及工业淀粉制品的原材料。然而目前,国内外还未见木薯可溶性淀粉合成酶基因Me SSs的启动子相关研究报道。本研究通过在木薯基因组数据库中查询Me SSⅡb基因第一个外显子及其上游序列,通过PCR扩增获得Me SSⅡb上游序列。对获得的上游序列通过Plant CARE及PLACE进行启动子结构及元件分析,并与其它物种中SSSs基因启动子区序列利用BLAST进行比对分析后,确立翻译起始位点上游1 566 bp序列为启动子区,进而设计并构建了包括完整启动子在内的5'端梯度缺失启动子融合GUS蛋白植物表达载体p E1566::GUS、p E1356::GUS、p E1116::GUS、p E531::GUS、p E453::GUS、p E387::GUS、p E138::GUS转化本氏烟草进行启动子活性验证。利用叶盘侵染法转化本氏烟草进行启动子梯度缺失分析后发现,缺失启动子p E1356、p E1116、p E531活性丧失,缺失至翻译起始位点上游138 bp的缺失启动子p E138,仍具有启动子活性。上述表明,在克隆启动子区1 566 bp片段中,在-1 566 bp和-1 356 bp之间210 bp序列片段对于完整启动子活性尤为重要,而-1 356 bp至-531 bp之间存在启动抑制因子,在-453 bp和-138 bp为基础启动序列,初步推断为转录起始结合位点。     

水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

水稻谷蛋白仅在水稻种子胚乳中表达,其启动子是分离胚乳特异性表达启动子的理想材料。本研究克隆了GluC基因启动子pGluC,生物信息学分析表明pGluC内部含有胚乳特异性表达所需要的Skn-1 motif和ACGT-box元件。将pGluC启动子和7个5'端缺失启动子片段构建到pGPTV-GUS载体上,转化水稻愈伤组织,进行组织化学染色和GUS酶活分析。结果表明：全长及截短的-1 911、-1 611、-1 311 bp启动子均能驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效稳定表达。-999、-451、-203、-102 bp启动子失去了胚乳表达特异性,在根、茎或者叶中也检测到GUS表达。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异高效表达提供了理论依据。     

水稻谷蛋白GluA-2基因5′上游序列控制下的UidA基因在转基因水稻胚乳中的表达模式

为了研究谷蛋白胚乳特异性表达启动子在我国栽培稻品种中的表达模式,将UidA基因分别置于水稻谷蛋白GluA—2基因750bp和2．3kb上游序列下游,利用农杆菌转化法导人栽培稻品种中花8号并获得转基因植株。Southern blot检测表明,UidA基因已经整合到水稻基因组当中并以单拷贝存在。Northern blot检测表明,开花后13～15d和11～13d,UidA基因和水稻内源的GluA—2基因的表达量分别达到最高,随后逐渐降低。对转基因植株种子的GUS染色表明,UidA基因仅在胚乳中表达,在糊粉层中GUS表达量最高。测定了2．3kb和750bp转基因植株种子的GUS活性,结果表明前者的GUS活性是后者的2～3倍。序列分析表明,位于GluA—2基因转录启始位点上游2170bD的G-box可能是一个与表达量相关的顺式调控元件。     

水稻细胞质1,6-二磷酸果糖酶基因1 195 bp的上游调控序列的克隆及其在转基因水稻中的表达研究

1,6-二磷酸果糖酶(EC3.13.11)催化1,6-二磷酸果糖分解为6-磷酸葡萄糖和无机磷酸.在高等植物的光合作用细胞中,存在两种1,6-二磷酸果糖酶:即叶绿体型1,6-二磷酸果糖酶和细胞质型1,6-二磷酸果糖酶.由于细胞质型1,6-二磷酸果糖酶在植物碳水化合物代谢中起重要作用,且具有表达特异性,本试验通过Genome Walking分离了水稻细胞质型1,6-二磷酸果糖酶基因的上游序列,并将其与β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因构建成嵌合表达载体.采用基因枪法转化水稻,在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.组织化学检测表明,在转基因水稻的成熟叶片中,GUS基因只在叶肉细胞中表达,在表皮细胞、泡状细胞、维管组织中均无表达;在叶鞘中的表达与叶片中相似,仅仅在叶肉细胞中表达;在根、茎所有细胞中均没有蓝色反应.为进一步研究1,6-二磷酸果糖酶基因启动子在水稻中的表达量,对12株独立来源的转基因水稻的GUS 活性进行了荧光定量分析.结果显示,水稻成熟叶片中的GUS活性平均值为7 031.5 pmol 4-MU-1*min-1*mg蛋白.在不同器官及组织中表达活性有差异,在转基因水稻的叶片、叶鞘中GUS均有较强的表达,在根、茎中未检测到GUS活性.实验结果表明,ATG上游1 195 bp调控区足以导致GUS基因在水稻中的特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式调控元件.     

植物遗传工程

921489单子叶植物LHCp启动子在转基因水稻中的表达〔英〕/Tada,Y.…2 EMBOJ一1991,10(7)一1803~1808〔译自DBA,1991,10(18),91-10498〕 通过电激将与编码水稻(Or夕za夕at苏公a)捕光叶绿素a/b光系统一n(LHCPll)结合蛋白启动子相连的户葡糖昔酸酶(GUS)基因(位于质粒PLHC4.4中)导入水稻。转化原生质体和愈伤培养物中由LHCP启动子控制的GUS基因表达远低于由花椰菜花叶病毒(CaMV)355启动子控制的,而在绿色器官中,LHCP启动子启动的LHCP-GUS活性比CaMV35S启动子启动尸的高10倍。在叶、茎和花组织中检测到LHCP一GUS基因的表…     

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视.本研究以pCAMBIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体.通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用.组织化学检测结果表明:CaMV35S启动子调控下的iGUS (带内含子)基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子(带内含子)调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子(带内含子)驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生.Ubi1启动子(带内含子)调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用.本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义.     

水稻细胞质1，6—二磷酸果糖酶基因1195bp的上游调控序列的克隆及其在转基因水稻中的表达研究

1,6－二磷酸果糖酶（EC3．13．11）催化1,6－二磷酸果糖分解为6－磷酸葡萄糖和无机磷酸。在高等植物的光合作用细胞中,存在两种1,6－二磷酸果糖酶：即叶绿体型1,6－二磷酸果糖酶和细胞质型1,6－二磷酸果糖酶。由于细胞质型1,6－二磷酸果糖酶在植物碳水化合物代谢中起重要作用,且具有表达特异性,本试验通过Genome Walking分离了水解细胞质型1,6－二磷酸果糖酶基因的上游序列,并将其与β－葡糖醛酸酶（GUS）报告基因建成嵌合表达载体。采用基因枪法转化水稻,在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性。组织化学检测表明,在转基因水稻的成熟叶片中,GUS基因只在叶肉细胞中表达,在表皮细胞,泡状细胞,维管组织中均无表达,在叶鞘中的表达与叶片中相似,仅仅在叶肉细胞中表达,在根,茎所有细胞中均没有蓝色反应,为进一步研究1,6－二磷酸果糖酶基因启动子在水稻中的表达量,对12株独立来源的转基因水稻的GUS活性进行了荧光定量分析。结果显示,水稻成熟叶片中的GUS活性平均值为7031．5pmol4-MU^-1.min^-1.mg蛋白。在不同器官及组织中表达活性有差异,在转基因水稻的叶片,叶鞘中GUS均有较强的表达,在根、茎中未检测到GUS活性,实验结果表明,ATG上游1195bp调控区足以导致GUS基因在水稻中的特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式调控元件。     

拟南芥AtMPK3启动子应答逆境信号的表达模式和必需区域分析

蛋白激酶AtMPK3参与MAPK级联途径, 在植物逆境信号转导中起重要作用. 为深入研究AtMPK3基因在转录水平上应答各种环境胁迫的分子机制, 本研究从拟南芥基因组中分离了AtMPK3基因转录起始位点上游1016 bp的启动子序列, 对其进行了生物信息学分析. 对该启动子进行了系列缺失突变, 并将完整启动子和缺失启动子片段与GUS报告基因融合, 转基因导入到拟南芥中. 携带AtMPK3启动子及其各种缺失突变体的转基因植株在干旱、高盐、低温、机械损伤等胁迫条件的GUS组织化学染色和荧光定量分析表明, AtMPK3启动子应答干旱、高盐、低温、机械损伤逆境信号的必需元件位于启动子序列中转录起始位点上游−188 ~ −62区域内, 揭示了AtMPK3启动子在不同环境胁迫条件下的表达模式的差异. 本研究结果有助于阐述AtMPK3基因在转录水平上应答不同胁迫信号分子机制.     

抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究

为确定拟南芥抗逆相关基因AtRPK1启动子的顺式功能元件,对其启动子区进行了分段克隆。通过5'端缺失方法得到203、316、604、809 bp 4个启动子片段,分别构建成p1300-pro-GUS表达载体,并转入拟南芥,进行GUS染色和GUS定量检测。通过对809 bp全长启动子转基因拟南芥GUS染色发现,转基因拟南芥的叶片、茎、花、根中均有表达,在分生能力强的组织和维管束集中的组织,AtRPK1基因启动子具有较高启动表达能力。5'端缺失启动子检测结果表明,转录起始点到启动子上游-114位点区域包含AtRPK1基因启动子的关键顺式作用元件。对启动子缺失片段转基因植株利用200 mmol·L-1NaCl胁迫3 h后,β-葡萄糖苷酸酶活力定量检测结果表明,在启动子上游-19位点处的GT-1顺式作用元件GAAAAA可能直接与盐胁迫应答相关。     

水葫芦EcGS1b基因启动子的克隆及表达分析

利用染色体步移技术从水葫芦基因组DNA中扩增得到谷氨酰胺合成酶EcGS1b基因5'端上游约1.7 kb的一段序列,经PlantCARE序列分析表明,该序列中除了包括TATA-box和CAAT-box等基本元件外,还含有TATC-box、HSE、LTR和多种光反应相关的元件,初步推测其为EcGS1b基因启动子,命名为pEcGS1b。进一步通过PCR扩增了4个5'缺失的pEcGS1b片段,命名为p1200、p900、p600、p400。以pBI121为基础,构建了4个以GUS为报告基因的植物表达载体,命名为p1200::GUS、p900::GUS、p600::GUS、p400::GUS。利用农杆菌介导的叶盘法将4个植物表达载体转化烟草叶片,进行瞬时表达。结果表明4个缺失片段均具有启动功能,但弱于组成型表达的花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子,其中p1200的启动活性最强。     

山葡萄几丁质酶基因VCH3启动子的分离及鉴定

利用接头PCR技术首次分离了长度为1 216bp的"双优"山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)classⅢ几丁质酶基因VCH3上游启动子序列(GenBank登录号AF441123),并用引物延伸方法鉴定了该启动子的转录起始位点,为5'-ATCAAGCAC-31序列中的第二个A.序列分析结果表明,代表真核基因启动子特征的CAAT盒和TATA盒分别位于VCH3启动子转录起始位点上游-122和-29处.另外,在转录起始位点上游-1 181 bp和-293 bp处各有一个水杨酸(SA)响应的顺式作用元件TGACG.为了鉴定该启动子的功能,将该启动子连接到β-葡糖苷酸酶基因(GUS)编码区的上游构建了VCH3启动子-GUS融合基因,并用农杆菌介导叶盘转化法将该融合基因转入烟草栽培品种NC89中.SA处理的转基因烟草根系和叶片GUS酶活性的荧光和组织化学检测结果表明VCH3启动子的驱动作用被SA诱导,因而该启动子在基因工程中将具有潜在的应用价值.     

水稻sbe1启动子驱动的反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究水稻基因启动子对外源基因在转基因水稻中表达的影响,构建了由sbe1启动子引导的反义sbe-GUS融合基因。经农杆菌介导,将不同的融合基因导入水稻中,定量测定转基因水稻植株不同组织中的GUS酶活力。结果表明,sbe1启动子可驱动反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻植株的胚乳中高效表达,而在颖壳、胚和茎叶等组织中的表达活性较弱。证实sbe1启动子在驱动外源基因的表达上表现有明显的组织特异性。