GCK基因和HNF-1α基因突变的研究

目的:研究一典型的青少年发病的成人型糖尿病家系并研究其基因突变位点。方法:以1个典型MODY家系的7名成员为研究对象,同时以10名无糖尿病家族史的普通2型糖尿病患者和10名健康人员为2个对照组。抽取外周血,分离白细胞,用快速盐析法提取基因组DNA,以基因组DNA为模板对HNF-1α基因的4号、2号和6号外显子和GCK基因的1号外显子进行PCR扩增,扩增产物经纯化后直接进行序列测定,并分别和各自的正常序列进行比较。结果:7名MODY家系成员HNF-1α2号外显子上游的内含子均存在一碱基G→A置换,即IVS2nt-42 G-A;4例存在HNF-1α6号外显子P380fsinsG移码突变,其中1例合并P379S点突变和IVS6nt-4G-A突变;1例存在P379S点突变;2例未发现突变和多态性。GCK基因的1号外显子及其内含子均未发现有突变或多态性。20名对照组成员均未发现有GCK1号外显子和HNF-1α2、4、6号外显子及其内含子的突变。结论:本家系是HNF-1α基因的6号外显子及其上游内含子突变(移码突变和/或点突变)和2号外显子上游内含子的一个碱基突变,该家系MODY属于MODY3。     

一性连锁Alport综合征中国家系COL4A5基因新突变位点的检测

通过PCR和直接测序的方法,对一性连锁Alport综合征家系17个受检个体的COL4A5基因所有51个外显子及其相邻内含子的DNA序列进行检测。结果发现,在第26外显子2240位点,男患者存在C碱基缺失(2240delc),女患者存在杂合缺失,同时对女患者相应的PCR产物进行克隆和测序以验证PCR测序结果的可靠性,而在正常家系成员和80例对照中均未发现此位点异常,说明2240delc为引起该家系临床病变的突变位点,不是多态性位点。在性连锁Alport综合征中,COL4A5基因的这个单碱基缺失突变位点为首次报道。     

27例雄激素不敏感综合征患儿AR基因突变

雄激素受体(AR)基因突变是雄激素不敏感综合征(AIS)的主要直接原因,本研究是为了了解中国病人AR基因突变谱.本研究根据病史、查体、激素检测、染色体核型分析及影像学检查结果,确诊AIS患儿27例.收集患儿及其部分家属静脉抗凝血,提取DNA,合成外显子1~8及外显子和内含子剪切处引物, PCR扩增,扩增产物送公司测序,分析AR基因突变情况.结果提示, 27例AIS患儿共发现突变23个, 10例携带5个相同突变(p.R841H, p.P914S,p.S176R, p.Y572S和p.Y782N),未报道突变11个. 8/27例家族史阳性. 12个已知突变中,仅1个为内含子4的剪切突变:c.2173+1GT;余均为点突变,含1个已报道的第6外显子的新生突变:p.R775C. 2例病人具有相同第8外显子突变:p.P914S,患者均表现为CAIS,与报道的PAIS不符;其余临床分型与已经报道的分型一致.未报道突变中,点突变为8/11个,另有2个碱基缺失导致的移码突变:p.345fs和p.828_829del, 1个碱基插入导致的移码突变:p.885fs, 1例病人携带两个点突变:p.Y365C和p.E898D.突变由多至少在外显子的分布:外显子7有6例患儿5个不同突变;外显子8有5例患儿4个突变,外显子1和5各有3个突变;外显子2, 3, 4和6各有2个不同突变. 23个突变在功能区的分布情况:16个突变位于LBD, 4个位于DBD, 3个位于NTD.本研究报道了不同AIS表型AR的突变谱, 50%为未报道突变,进一步丰富了AR数据库.错义突变是主要形式,且大部分位于LBD区.携带相同突变的病人可呈现不同表型.     

环状RNA在肝细胞癌中的作用及机制

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）治疗困难、预后很差,是肿瘤相关死亡中的第4大癌症,严重危害人类生命健康,但其具体发病机制却仍未完全阐明。因此,探索能调控肝细胞癌发生发展,作为肝细胞癌的诊断标志物或能预测患者预后的关键分子仍十分必要。环状RNA是前体mRNA通过反向剪接产生的由3′, 5′ 磷酸二酯键首尾连接形成的共价闭合环状结构,主要有外显子circRNA（exonic circRNA,ecircRNA）、环状内含子RNA（circular intronic RNA,ciRNA）及外显子 内含子circRNA（exon-intron circRNA,EIciRNA）三大类。由于环状RNA具有普遍性、高度保守性和稳定性,其可以参与多种癌症的发生发展过程,并且可作为肿瘤的早期诊断标志物及预后因子,因此,这是一类新型且非常有潜力应用于临床诊治各阶段的分子。近年来,有大量关于环状RNA与肝细胞癌的研究。这些研究表明,环状RNA在肝细胞癌发生发展进程中发挥的作用十分重要,并且其机制多样。因此,本文主要关注环状RNA在肝细胞癌中的最新进展,总结不同环状RNA分子对于肝细胞癌细胞恶性表型、肿瘤干细胞及肿瘤微环境中免疫细胞的作用,以及其在肝细胞癌临床转移、分期、诊断、预后等各阶段中发挥的功能及其具体作用机制。此外,本文还提出了目前研究中存在的一些问题和不足,以期为未来的研究提供一些新的思路及策略。     

环状RNA在肝细胞癌中的作用及机制

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）治疗困难、预后很差,是肿瘤相关死亡中的第4大癌症,严重危害人类生命健康,但其具体发病机制却仍未完全阐明。因此,探索能调控肝细胞癌发生发展,作为肝细胞癌的诊断标志物或能预测患者预后的关键分子仍十分必要。环状RNA是前体mRNA通过反向剪接产生的由3′, 5′ 磷酸二酯键首尾连接形成的共价闭合环状结构,主要有外显子circRNA（exonic circRNA,ecircRNA）、环状内含子RNA（circular intronic RNA,ciRNA）及外显子 内含子circRNA（exon-intron circRNA,EIciRNA）三大类。由于环状RNA具有普遍性、高度保守性和稳定性,其可以参与多种癌症的发生发展过程,并且可作为肿瘤的早期诊断标志物及预后因子,因此,这是一类新型且非常有潜力应用于临床诊治各阶段的分子。近年来,有大量关于环状RNA与肝细胞癌的研究。这些研究表明,环状RNA在肝细胞癌发生发展进程中发挥的作用十分重要,并且其机制多样。因此,本文主要关注环状RNA在肝细胞癌中的最新进展,总结不同环状RNA分子对于肝细胞癌细胞恶性表型、肿瘤干细胞及肿瘤微环境中免疫细胞的作用,以及其在肝细胞癌临床转移、分期、诊断、预后等各阶段中发挥的功能及其具体作用机制。此外,本文还提出了目前研究中存在的一些问题和不足,以期为未来的研究提供一些新的思路及策略。     

一个中国Gilbert综合征家系的遗传学分析

对一个中国汉族Gilbert综合征遗传家系致病基因突变位点进行鉴定,以期了解该病的分子遗传学基础。首先提取先证者基因组DNA,PCR扩增尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1基因的5个外显子,以琼脂糖电泳鉴定PCR产物,纯化后直接测序鉴定。基因扫描显示,与血清胆红素水平密切相关的UGT1A1基因在第1和第5外显子存在纯合突变,而 UGT1A1基因启动子区域和内含子/外显子剪接边界位点序列未检测到突变。进一步对其他家系成员该基因的相应位点进行突变检测,结果显示他们在第1和第5外显子也存在杂合突变,其中还有两个成员在启动子区域检测到(TA)插入突变。对家系成员未抗凝新鲜血液进行生化检测证实了基因突变分析的结果。综合以上结果发现该家系三种突变并存,致病因素为第1和/或第5外显子突变,为显性遗传,两种突变位点纯合导致先证者出现严重胆红素代谢功能障碍。该家系因此成为Gilbert综合征突变位点及其致病机理研究的一个典型临床病例。     

贵州地方山羊ADAMTS1基因序列多态性及生物信息学研究

本研究选择黔北麻羊和贵州黑山羊为试验对象,分别构建DNA池,结合PCR产物直接测序法分析两品种中ADAMTS1基因外显子2~8中可能与繁殖性状相关的单核苷酸多态位点。结果表明在黔北麻羊和贵州黑山羊两个群体中共检测到ADAMTS1基因的10个SNPs位点,其中该基因第2、5、6外显子中各存在1个SNP位点,依次是C266T、T2210C、C2513A,均引起所编码氨基酸的同义突变,第3、4、6、8内含子中各存在1个SNPs位点,依次是C1073T、A1326G、G2698A、T4261A,第7内含子中同时存在3个SNPs位点,为T3401C、T3045T、T3064C,其中9个SNPs位点(C266T,C2513A,C1073T,A1326G,G2698A,T4261A,T3401C,T3045G,T3064C)为两品种所共有,T2210C仅存在黔北麻羊中。位点A1326G的A和G等位基因频率在检测的两个羊种间差异较大,通过后续的生物信息学分析显示,ADAMTS1基因外显子2的C266T和外显子6的优势突变C2513A的位点变异共同引起m RNA二级结构发生显著改变。     

乳腺癌组织中EGFR/KRAS/BRAF基因突变检测与分析

[目的]检测乳腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)以及其下游KRAS、BRAF基因的突变类型和突变率,分析其各突变类型之间有无相关性,以期为乳腺癌药物靶点筛选和乳腺癌患者的分子靶向治疗提供更多依据。[方法]取自2016～2017年间宜昌市中心人民医院病理科收集的乳腺癌患者术后冰冻肿瘤组织样本60例以及健康人群DNA样本30例,分别提取基因组DNA,采用PCR扩增和基因测序的方法对基因组中的EGFR外显子18～21,KRAS外显子2、3以及BRAF外显子15进行基因突变分析。[结果]在检测的60例乳腺癌组织样本中,总计有8例样本存在错义突变。其中EGFR突变率为11.7%(7/60例),均为外显子18和20突变。包括第18号外显子P699A突变3例,突变率为5.0%;第20号外显子L778M、V819A突变各4例,突变率6.7%。并包含3例L778M合并V819A突变,另有2例中分别出现了I780M合并S783C和L788V合并L815F突变。BRAF外显子15仅出现了1例T599P突变,突变率为1.7%(1/60例)。30例正常人群对照组未检测到错义突变。[结论]EGFR在乳腺癌中的突变主要以外显子18和20为主,存在P699A、L778M、V819A突变且突变率高达11.7%。BRAF在乳腺癌中的突变率极低,仅为1.7%。未检测到乳腺癌组织中KRAS突变。与正常组织相比较,EGFR外显子18和20的高突变率提示其与乳腺癌的发病存在密切关系,EGFR突变是潜在的抗乳腺癌治疗靶点。     

PTEN基因突变及蛋白表达与胃印戒细胞癌的相关性研究

目的:探讨胃印戒细胞癌组织中PTEN基因突变及其蛋白表达异常与胃印戒细胞癌发生、发展和临床病理特征的相关性.方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法检测36例胃印戒细胞癌组织和36例正常胃组织中PTEN基因突变情况,同时应用链霉菌抗生物蛋白一过氧化酶(S-P)免疫组化方法检测PTEN蛋白的表达并结合临床病理资料进行分析.结果胃印戒细胞癌组织PTEN的表达36.1%,明显低于正常组织94.4%,二者具有显著性差异(P<0.01);PTEN表达与性别和年龄无相关性(P>0.05).与浸润深度、淋巴结转移有相关性(P<0.05);36例胃印戒细胞癌组织中PTEN外显子5突变3例(8.33%),突变位点相对较集中,显示其突变热点主要位于161、162号密码子.结论:PTEN在胃印戒细胞癌组织中表达降低,与其浸润深度、淋巴结转移密切相关.胃印戒细胞癌中PTEN基因突变是其蛋白表达缺失原因之一.     

中国人先天性巨结肠RET基因突变特征研究

为了研究中国人先天性巨结肠(HD)RET基因突变特征,从分子水平探讨先天性巨结肠症(HD)的发病机理,揭示中国人群HD与RET基因突变的关系。我们应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)-DNA测序方法,对50例HD患儿和30例无便秘正常对照者,进行RET基因第13外显子突变筛查,并对第13外显子突变阳性患儿家系作研究。结果发现在50例HD患儿中,有7例第13外显子扩增片段在SSCP分析时出现泳动变位。经DNA测序证实,有3种点突变类型(错义、同义和移码),第13外显子突变率为14％(7／50)。在7例第13外显子突变的患儿中,发现2例患儿的父亲存在与其子相同的突变。实验表明中国先天性巨结肠人群存在着RET基因突变,且以杂和性点突变为主,HD具有一定的遗传性。     

人肝细胞癌中抑癌基因PTEN／MMAC1／TEP1的突变分析

PTEN/MMAC1/TEP1 is a tumor suppressor gene. Its mutation has been found in several different types of human cancers. 34 primary human hepatocellular carcinomas have been examined for mutations in exon 5 and exon 8 of the PTEN gene. Exon 5 and exon 8 were amplified by polymerase chain reaction (PCR) with intronic primers and subjected to single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. SSCPs were found in 4 of the 34 hepatocellular carcinomas analyzed. Direct sequencing of the PCR products identified single base-pair substitutions in the four tumor DNA samples, two in intron 4 and two in exon 8. One of the base-pair substitution in exon 8 is a missense mutation, which changed codon 304 of PTEN protein from Cys to Gly. These data suggest that PTEN may be involved in the carcinogenesis and development of hepatocellular carcinoma.     

猪POU1F1基因部分序列变异和同源性分析

对长白、杜洛克、约克夏、姜曲海、梅山和香猪等六个猪种的POU1F1基因第四、第五和第六外显子分别进行PCR扩增,并对含有第四、第六外显子的PCR产物和含有第五外显子的克隆产物进行测序。结果表明：六个猪种中,POU1F1基因的第四外显子存在碱基突变,为T→C。对该序列进行Nla Ⅲ 酶消化,产生两种不同的基因型(GG和HH);而第五和第六外显子则高度保守,未发现任何突变。将人POU1F1基因第四外显子、POU同源区核苷酸编码序列和氨基酸序列,分别与猪、小鼠、牛的POU1F1基因相应的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较,结果发现：人与猪、小鼠、牛的POU1F1基因第四外显子的核苷酸同源性分别高达93.9%、86.7%、92.1%,而由第四外显子编码的部分POU特异区的氨基酸序列则完全一致;人与猪、小鼠、牛POU同源区的核苷酸同源性分别为91.4%、85.1%、87.9%,氨基酸同源性分别为96.6%、94.8%、90.2%。这说明在哺乳动物中,其POU1F1蛋白的POU同源区和由第四外显子编码的POU特异区部分是高度保守的;猪可作为实验动物,建立人类相关疾病模型,为医学研究提供参考依据。     

Genetic alterations in the Catnb gene but not the H-ras gene in hepatocellular neoplasms and hepatoblastomas of B6C3F(1) mice following exposure to diethanolamine for 2 years

The present study characterized the immunohistochemical localization of beta-catenin protein in hepatocellular neoplasms and hepatoblastomas in B6C3F(1) mice exposed to diethanolamine (DEA) for 2 years and evaluated genetic alterations in the Catnb and H-ras genes which are known to play important roles in the pathogenesis of liver malignancies. Genomic DNA was isolated from paraffin sections of each liver tumor. Catnb exon 2 (corresponds to exon 3 in human) genetic alterations were identified in 18/18 (100%) hepatoblastomas from DEA exposed mice. Deletion mutations (15/18, 83%) were identified more frequently than point mutations (6/18, 33%) in hepatoblastomas. Eleven of 34 (32%) hepatocellular adenomas and carcinomas from DEA treated mice had mutations in exon 2 of the beta-catenin gene, while only 1 of 10 spontaneous neoplasms had a deletion mutation of codon 5-6. Common to all liver neoplasms (hepatocellular adenomas, carcinomas and hepatoblastomas) was membrane staining for the beta-catenin protein, while cytoplasmic and nuclear staining was observed only in hepatoblastomas. The lack of H-ras mutations in hepatocellular neoplasms and hepatoblastomas suggests that the ras signal transduction pathway is not involved in the development of liver tumors following DEA exposure which is different from that of spontaneous liver tumors that often contain H-ras mutations.     

Germline PTEN promoter mutations and deletions in Cowden/Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome result in aberrant PTEN protein and dysregulation of the phosphoinositol-3-kinase/Akt pathway

Germline intragenic mutations in PTEN are associated with 80% of patients with Cowden syndrome (CS) and 60% of patients with Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome (BRRS). The underlying genetic causes remain to be determined in a considerable proportion of classic CS and BRRS without a polymerase chain reaction (PCR)-detectable PTEN mutation. We hypothesized that gross gene deletions and mutations in the PTEN promoter might alternatively account for a subset of apparently mutation-negative patients with CS and BRRS. Using real time and multiplex PCR techniques, we identified three germline hemizygous PTEN deletions in 122 apparently mutation-negative patients with classic CS (N=95) or BRRS (N=27). Fine mapping suggested that one deletion encompassed the whole gene and the other two included exon 1 and encompassed exons 1-5 of PTEN, respectively. Two patients with the deletion were diagnosed with BRRS, and one patient with the deletion was diagnosed with BRRS/CS overlap (features of both). Thus 3 (11%) of 27 patients with BRRS or BRRS/CS-overlap had PTEN deletions. Analysis of the PTEN promoter revealed nine cases (7.4%) harboring heterozygous germline mutations. All nine had classic CS, representing almost 10% of all subjects with CS. Eight had breast cancers and/or benign breast tumors but, otherwise, oligo-organ involvement. PTEN protein analysis, from one deletion-positive and five PTEN-promoter-mutation-positive samples, revealed a 50% reduction in protein and multiple bands of immunoreactive protein, respectively. In contrast, control samples showed only the expected band. Further, an elevated level of phosphorylated Akt was detected in the five promoter-mutation-positive samples, compared with controls, indicating an absence of or marked reduction in functional PTEN. These data suggest that patients with BRRS and CS without PCR-detected intragenic PTEN mutations be offered clinical deletion analysis and promoter-mutation analysis, respectively.     

肌萎缩侧索硬化患者SOD1基因突变检测及突变与临床表型的关系

应用PCR技术结合DNA直接测序方法对8例临床确诊为家族性肌萎缩侧索硬化(Familiar amyotrophic lateral sclerosis,FALS)家系的先证者进行铜锌超氧化物歧化酶基因(SOD1)的突变筛查,在3例先证者中检出2种SOD1基因突变,其中,2例携带了位于4号外显子的错义突变Cys111Tyr(c.332G>A),另1例携带了位于5号外显子的错义突变Gly147Asp(c.440G>A),这2种突变在中国ALS患者中属首次报道。该结果扩大了中国FALS患者的SOD1基因突变谱,对研究中国FALS患者SOD1基因突变特点和分布规律有一定帮助。分析携带这2个突变患者的临床特点,提示Cys111Tyr突变导致的临床表型相对温和,而Gly147Asp突变可导致病情进展较快。该结果有待在更多的病例中进行证实。