SDS-PAGE纤维蛋白自显影法检测不同分子量的纤溶酶原激活剂

体内存在两种纤溶酶原激活剂(plasminogen activator, PA):血液中生理性的组织型纤溶酶原激活剂(t PA)及尿中的尿激酶型纤溶酶原激活剂(u PA)。它们通过将纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶而启动纤溶过程使血栓溶解。目前模拟体内纤溶过程以纤维蛋白为底物的PA物质活性测定方法有纤维蛋白溶圈法和发光分析法,但这两种方法不能     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA的克隆

组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plas-minogen activator,tPA)是一个由527个氨基酸残基组成的蛋白质,分子质量约69ku。 tPA是一种丝氨酸蛋白水解酶,在纤维蛋白存在的条件下,可使血浆纤溶酶原转变为纤溶酶;如果没有纤维蛋白的存在,它使纤溶酶原转变为纤溶酶的能力有限。当静脉给予药理剂量的tPA时,它与血栓处的纤维蛋白结合,同时把捕捉的纤溶酶原转变为纤溶酶,使纤维蛋白的溶解在血栓处发生,而并非全身性。这样可以减少全身性出血副作用,这也更是tPA优于尿激酶和链激酶之处。tPA临床上主要用于治疗血栓性疾病,如急性心肌梗塞,肺栓塞,视网     

卵巢纤蛋白溶酶原激活因子及其抑制因子的研究

本文综述了近年来作者在研究卵巢纤蛋白溶酶原激活因子(PA)及其抑制因子(PAI)的某些成果。PA是一种高效能蛋白水解酶激活因子,它激活纤蛋白溶酶原成为纤蛋白溶酶,此酶在纤蛋白水解过程中起重要作用。已有证据表明,PA与排卵有关。我们进一步研究发现:(1)在大鼠卵巢体细胞中存在两种PA,即组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA);而在卵细胞中只发现tPA;(2)大鼠卵巢tPA明显受促性腺激素和其他激素调节,并在排卵前达到高峰,而uPA没有明显变化;(3)在卵巢体细胞中还发现一种PA的抑制因子(PAI),它与PA结合形成复合体,能部分或完全消除PA活性;(4)只有tPA与大鼠排卵有关;PA和PAI间的相互作用和随激素的波动而引起的动态变化可能对维持卵巢正常生理功能和排卵起重要作用。     

用色原及凝溶试验法测定组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)的效价

<正>组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)是一种限定特异性的丝氨酸蛋白酶,它是纤维蛋白溶酶系统最重要的生理激活剂。在血纤维蛋白存在时,TPA催化酶原纤维蛋白溶酶原转化成它的活性形式,血纤维蛋白溶酶。在体内,血纤维蛋白溶酶的主要目标是纤维蛋白。纤维蛋白溶解方面的最新进展导致了免疫反应TPA和催化部位TPA的敏感试验法的发展。测量催化活性的TPA试验似乎依赖于纤维蛋白原/纤维蛋白碎片的存在,这些碎片是用溴化     

抗凝血蛋白质分子的研究现状*

凝血酶抑制剂、纤溶酶原激活剂 (t PA、u PA、SK和SAK等 )、蚯蚓纤溶酶和蛇毒抗凝血蛋白等是血栓类疾病领域的研究重点。纤溶分子突变体的应用、纤维蛋白水解特异性的增加、溶栓效率的提高以及半衰期的延长等是溶栓剂研究的方向。     

重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测

人组织纤溶酶原激活剂(ht-PA)是临床血栓疾病治疗的主要生物药品,应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道,但重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K1区位点缺失体为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rh PA,通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔,ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只(2♂,3♀),其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂,rh PA浓度最高可达400μg/m L,表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明,重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达,表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。     

蕲蛇酶溶栓和抗栓作用机理

蕲蛇酶以全面改善纤溶系统各组份功能 ,诱导血管内皮细胞释放 t- PA,t- PA将纤维蛋白溶酶原变成纤溶酶 ,溶解血栓。此外 ,本品分解血纤维蛋白原 ,生成降解 A肽纤维蛋白单体 ,从而促进 t- PA激活纤维蛋白溶酶原转变成纤溶酶效应 ,促进溶栓。　　蕲蛇酶是目前唯一对各种诱导剂引起的血小板聚集都具有明显抑制作用的药物。蕲蛇酶对新鲜性、陈旧性 ,及各种模型动静脉血栓均具溶栓作用蕲蛇酶溶栓和抗栓作用机理     

蕲蛇酶溶栓和抗栓作用机理

蕲蛇酶以全面改善纤溶系统各组份功能 ,诱导血管内皮细胞释放 t- PA,t- PA将纤维蛋白溶酶原变成纤溶酶 ,溶解血栓。此外 ,本品分解血纤维蛋白原 ,生成降解 A肽纤维蛋白单体 ,从而促进 t- PA激活纤维蛋白溶酶原转变成纤溶酶效应 ,促进溶栓。　　蕲蛇酶是目前唯一对各种诱导剂引起的血小板聚集都具有明显抑制作用的药物。蕲蛇酶对新鲜性、陈旧性 ,及各种模型动静脉血栓均具溶栓作用。蕲蛇酶溶栓和抗栓作用机理     

尿激酶与肿瘤转移

尿激酶是一种丝氨酸蛋白水解酶,它能激活纤溶酶原成为纤溶酶,降解胞外基质,从而利于细胞迁移。肿瘤转移是导致肿瘤恶化和肿瘤病人死亡的主要原因之一。以尿激酶为中心,尿激酶受体介导的纤溶酶原激活系统在肿瘤转移过程中扮演了重要角色。     

尿激酶原变体Glu151-Glu154-mscu-PA的构建及其动力学性质

利用寡核苷酸介导的定点突变方法 ,将重组人尿激酶原 ( recombinant single chain uroki-nase- type plasminogen activator,rscu- PA)中 1 51位赖氨酸 ( Lys1 51 )突变为谷氨酸 ( Glu1 51 ) ,1 54位精氨酸 ( Arg1 54)突变为谷氨酸 ( Glu1 54) ,得到尿激酶原变体基因 ( mscu- PA) .尿激酶原变体和未突变的重组尿激酶原均在 E.coli中获得表达 ,超声后所得包涵体经体外变复性并得到纯化 .结果表明 ,尿激酶原变体对纤溶酶 ( plasmin)的敏感性比未突变的重组尿激酶原低约 40 % ,转变纤溶酶原 ( Glu- plasminogen)为纤溶酶的活性基本相同 .两种产物经纤溶酶活化后 ,分别得到了双链尿激酶 ( rtcu- PA)和双链尿激酶变体 ( mtcu- PA) .它们对人工合成的发色底物 S2 4 4 4反应的动力学基本一致 ,对 Glu- plasminogen的催化反应的米氏动力学常数 Km 基本一致 ,但 mtcu- PA的 Kcat仅为rtcu- PA的 80 % .酪蛋白降解系统 ( caseinolytic system)实验表明 ,在纤维蛋白和纤溶酶原存在的情况下 ,尿激酶原变体较未突变尿激酶原能加快酪蛋白的降解 ,说明 mtcu- PA对纤维蛋白有一定的亲和性     

人纤溶酶原激活剂的抑制物2在昆虫细胞中的表达

纤溶酶原激活剂（Plasminogen Activator,PA）对血液中蛋白水解酶的活性有重要的调节作用。纤溶酶原激活剂的抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor,PAI）可物异地抑制PA（t-PA和u-PA）,其作用迅速,是PA活性的重要调节因子。很多证据表明,PAI、Pat和体内许多生理反应有密节的关系,如炎症^[1]、组织重塑^[2]、肿瘤生长及恶性细胞的转移^[3,4]等。目前已发现了四种类型的PAI,PAI-2是基中的一种,它可由人胎盘滋养层细胞合成,在孕妇血浆中大理存在^[5].该蛋白具有两种形式：一种分子量为43~47kDa的非糖基化形式：另一种分子量为58~60kDa的糖基化形式^[6,7].对其结构与功能深入的研究将有助于了解许多生于现象,但由于PAI-2基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达都不理想,不能获得足够量的该活性蛋白,本文在以轩状病毒为载体在昆虫细胞中成功地表达了该基因。     

急性心肌梗死的静脉溶栓治疗

80年代以来 ,急性心肌梗死 ( AMI)的治疗进入再灌注治疗年代 ,其中静脉溶栓治疗应用最为广泛。因其简便易行 ,适合基层医院开展 ,也可在院外及时溶栓争取时间 ,降低 AMI的病死率 ,现将近年来静脉溶栓治疗 AMI的研究状况综述如下。1　溶栓概念　　溶栓是用药物使结合于纤维蛋白的纤维蛋白溶酶原激活成纤维蛋白溶酶 ,促使纤维蛋白的溶解 ,即溶栓作用。溶栓治疗就是给予纤溶酶原活化因子 ,通过它们激活血液的纤溶系统达到溶解血栓的作用。2溶栓剂　　 ( 1 )尿激酶 ( UK)是国内首选的纤溶剂 ,它可催化纤溶酶转化为纤溶酶原的活化因子 ,无抗…     

血纤维蛋白溶酶原激活剂的研究进展

血纤维蛋白溶酶原激活剂(Plasminogen Activator,简称PA)由于与许多基本的细胞生理现象有关,如细胞分裂、细胞伸展、肿瘤浸润和转移灶的生长等,因而引起了人们的注意。近年来对它的研究日益增多和深入。本文就有关PA的一些性质、检测方法以及在细胞生理及病理过程中某些有关功能作一简述。     

重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达

【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rt PA,插入分泌型表达载体p PIC9K中,获得重组表达质粒p PIC9K-rt PA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后,电击转化至3种不同表型的P.pastoris(GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D处有特异性条带,且前者在32 k D处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rt PA-SMD1168无降解现象,且rt PA-SMD1168比活性较rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发,P.pastoris SD1168可作为rt PA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,P.pastoris GS115也是rt PA表达的优选体系。     

溶栓剂研究的新进展

近年来对溶栓剂的研究取得了很好的成果 ,主要集中在单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scu PA) ,组织型纤溶酶原激活剂 (t PA) ,葡萄球菌激酶 (SAK)等 ,对分子进行设计改造 ,保留它们高效的溶栓功能同时赋予新的功能。在对分子空间结构域和活性功能区分析的基础上 ,研制出更有效的、更安全的溶栓制剂具有广阔的发展前景。     

重组组织型纤溶酶原激活剂的纯化和鉴定

介绍一种简便高效的两步纯化重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的方法,产rt-PA的CHO工程细胞SGG培养上清,经微孔玻璃珠(MPG)吸附和赖氨酸-Sepharose 4B柱亲和吸附色谱纯化,纯化倍数平均达到380倍,比活性为390 000 U/mg蛋白,rt-PA活性回收率达到140%,经SDS-PAGE还原电泳分析主要为t-PA蛋白,其中高分子t-PA占80％左右.用纤维蛋白自显影法检测均有溶纤活性,蛋白质印迹证实具有t-PA的抗原性.     

重组纤溶酶原激活剂抑制剂－2基因在HT1080亚克隆中的表达

重组纤溶酶原激活剂抑制剂－２基因在ＨＴ１０８０亚克隆中的表达曹祥荣（南京师范大学生物学系,２１００２４）关键词纤溶酶原激活剂,基因重组,纤溶酶原激活剂抑制剂活性表达目前认为纤溶酶系统是肿瘤细胞浸润和转移蛋白水解过程中重要的酶,纤溶酶能直接水解细胞外间...     

纳豆激酶基因工程研究进展

纳豆是日本的民间传统食品,1987年日本学者须见洋行从纳豆中分离提取和纯化出一种具有纤溶活性的蛋白激酶,称之为纳豆激酶(Nattokinase,NK)。它是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)经发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶,该酶能显著溶解体内外血栓,明显缩短优球蛋白的溶解时间,并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂(Sumi H,1987年)。     

高纯度α_1-抗胰蛋白酶的提取、抗血清的制备及其火箭免疫电泳测定

α_1-抗胰蛋白酶(a_1-AT)是肝细胞分泌的一种糖蛋白,是血浆蛋白电泳α_1球蛋白的主要成份。它能抑制多种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶等的活性。     

可口革囊星虫体内纤溶酶的初步研究

目的从可口革囊星虫中寻找到纤溶酶,并对其进行初步研究。方法采用匀浆、抽提离心、Sephacryl S-300凝胶过滤等方法对可口革囊星虫纤溶酶初步分离,用纤维蛋白平板法和合成发色底物法检测其纤溶活性,并用该酶进行体外溶血凝块实验。结果可口革囊星虫内脏中存在纤溶酶。此酶既直接降解纤维蛋白又间接激活纤溶酶原,它对体外血凝块有明显溶解作用。结论可口革囊星虫内脏中存在着一种既具直接降解纤维蛋白作用又具激活纤溶酶原作用的纤溶酶。