慢病毒载体转录通读率检测方法的建立

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一.为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方法.文中运用分子生物学等手段,将相关质粒瞬时转染入293T细胞,模拟野生型和自灭活型慢病毒载体整合入染色体后的情况,利用实时荧光定量PCR分别定量转录通读和总转录本在慢病毒载体上的特征序列,并计算出转录通读率;同时使用流式细胞计数等技术,检测转录通读后的GFP蛋白产物.两种检测结果均与理论相符,即自灭活型载体具有更高的转录通读率.说明文中所建立的方法有效可靠,为进一步评估和降低慢病毒载体的转录通读率,提高慢病毒载体的生物安全性的研究提供技术支持.     

Ratiometric-pericam-mt慢病毒的构建及其线粒体钙检测功能的验证

目的:基于由环状异构黄色荧光蛋白(Circularly Permuted EYFP)改造的具有线粒体定位功能的Ratiometric-pericam-mt(rp-mt)荧光蛋白构建携带有rp-mt基因的慢病毒载体,验证其在线粒体钙检测中的功能,为进一步研究线粒体钙稳态在细胞生命活动中发挥的作用提供参考依据。方法:采用慢病毒载体EF-1αF-puro和rp-mt质粒构建携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体,经脂质体法在293T细胞中与包装质粒共转染,收集构建好的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt并体外感染人肝癌细胞SNU-739,验证重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt的活性功能。结果:以慢病毒载体EF-1αF-puro为骨架质粒,成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体(EF-1αF-puro-rp-mt),收集获得的重组慢病毒滴度为4×10~6TU/m L。将携带有rp-mt基因的慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt感染SNU-739细胞48小时后,在荧光显微镜下观察到有超过85%的细胞发出绿色荧光,定位于细胞线粒体内,且对SNU-739细胞进行Ru360和CGP37157处理后,细胞荧光强度随线粒体内钙水平改变而增强或减弱。结论:采用脂质体包装法成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt,细胞经该慢病毒转染后可稳定表达具有线粒体定位功能的荧光蛋白rp-mt,准确地检测细胞线粒体钙离子水平。     

慢病毒载体转录“通读”改进研究进展

自2002年以来,在用γ-逆转录病毒载体治疗X连锁重度复合性免疫缺陷病 (X-SCID) 的10例病人中已有4例因载体整合在原癌基因lmo2等附近而得了白血病。这一事件提高了人们对基因治疗载体安全性的关注。与γ-逆转录病毒载体相比,慢病毒载体因尚未发现有整合在lmo2附近的现象,被认为是安全性较好的基因治疗载体。然而自灭活慢病毒载体与γ-逆转录病毒载体一样存在着转录“通读”的现象。近些年来,科学家们在改善自灭活慢病毒载体的通读率上做了一些工作并取得了一些积极成果。以下对慢病毒载体转录“通读”现象的发生机理和解决途径作了综合描述。     

用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

慢病毒是逆转录病毒的一种 ,具有逆转录病毒的基本结构 ,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性 ,作为基因治疗载体发展起来 ,最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒一样 ,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA上 ;由于病毒载体经改构后 ,不在宿主细胞增殖 ,不会导致寄主细胞的死亡 ,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代 ;这种载体的最大优势是能感染静止细胞和不产生嵌合体动物。详细介绍了慢病毒载体构建原理、近年慢病毒载体在转基因动物制备方法和应用研究的新进展。     

miR-455慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建人源microRNA-455（miR-455）慢病毒载体,并鉴定成熟has-miR-455在细胞内的表达水平。方法：提取siHa细胞中的人基因组DNA,设计并合成人miR-455的上下游引物,PCR扩增目的基因,将其中表达miR-455的结构经酶切后插入慢病毒转移质粒pWPT-GFP,构建成pWPT-GFP-pri-miR-455,在293T细胞中与pMD2G、pSPAX2包装产生慢病毒,并用含慢病毒的上清感染SiHa细胞。结果：测序结果证明插入质粒载体中的miR-455前体序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒;重组慢病毒质粒pWPT-GFP-pri-miR-455感染SiHa细胞后上调miR-455的表达近40倍。结论：构建了miR-455的慢病毒载体,并能在293T细胞中表达,产生的慢病毒能成功感染SiHa细胞。为进一步研究miR-455的功能,以及利用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。     

HBV prec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建和鉴定

目的构建针对HBV prec/c区的shRNA真核表达载体psiHBV,感染HepG2 2.15细胞后观察其对HBeAg表达的抑制作用,为探讨防治HBV感染的新措施提供实验依据。方法针对HBV prec/c基因序列,构建shRNA表达载体psiHBV1、psiHBV2和无关序列psiHBVc。psiHBV与慢病毒辅助系统质粒共转染293T细胞组装慢病毒颗粒后,感染HepG2 2.15细胞,RT-PCR检测prec/c mRNA的转录,微粒子化学发光分析仪(MEIA)检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达。结果重组质粒双酶切和测序鉴定与预期结果相符合;组装慢病毒颗粒感染HepG2 2.15细胞后,prec/c mRNA转录降低;与对照组比较,HBeAg的表达水平也显著降低,病毒颗粒对HBeAg表达的抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建针对HBVprec/c的慢病毒载体psiHBV1、siHBV2,慢病毒介导的RNA i能抑制HBV表达,为应用RNA干扰技术治疗乙型肝炎提供了实验依据。     

一种新型慢病毒载体制备体系的初步建立

为了建立新型、高产量的慢病毒载体制备体系,将构建好的主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞.再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4天后,收集培养上清.提取培养上清的RNA,进行RT-PCR反应,将培养上清进行免疫印迹鉴定,将培养上清感染正常的293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞,荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况,采取3×3×3析因分析方法,优化系统产量,Real-timePCR方法测定细胞培养上清中病毒载体的拷贝数,利用流式细胞术检测病毒载体滴度.RT-PCR及p24免疫印迹结果均提示在细胞上清中存在慢病毒载体;通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞均表达绿色荧光蛋白GFP,说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性;系统经优化后,培养上清中慢病毒载体拷贝数达到1.1×1012/ml,培养上清原始滴度达到1.3×108tu/ml,高出目前常用制备体系产量1个数量级.上述结果表明,新型慢病毒载体制备体系已初步建立,为今后该系统的大规模应用提供客观的科学依据.     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

一种新型慢病毒载体制备方法的建立

为了建立新型、高产量的慢病毒载体制备体系,将构建好的主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞,再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4d后,收集培养上清,提取培养上清的RNA,进行RT-PCR反应;将培养上清进行免疫印迹鉴定;将培养上清感染正常的293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞,荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况;采取3*3*3析因分析方法,优化系统产量,Real-time PCR方法测定细胞培养上清中病毒载体的拷贝数,利用流式细胞术检测病毒载体滴度。RT-PCR及p24免疫印迹结果均提示在细胞上清中存在慢病毒载体;通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞均表达绿色荧光蛋GFP,说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性;系统经优化后,培养上清中慢病毒载体拷贝数达到(11.71±0.80)×1011copies/mL,培养上清原始滴度达到(1.3±0.18)×108tu/mL,高出目前常用制备体系产量1个数量级。初步建立了新型慢病毒载体制备体系,为今后该系统的大规模应用提供客观的科学依据。     

Cauliflower mosaic virus protein P6-TAV plays a major role in alteration of aphid vector feeding behaviour but not performance on infected Arabidopsis

Emerging evidence suggests that viral infection modifies host plant traits that in turn alter behaviour and performance of vectors colonizing the plants in a way conducive for transmission of both nonpersistent and persistent viruses. Similar evidence for semipersistent viruses like cauliflower mosaic virus (CaMV) is scarce. Here we compared the effects of Arabidopsis infection with mild (CM) and severe (JI) CaMV isolates on the feeding behaviour (recorded by the electrical penetration graph technique) and fecundity of the aphid vector Myzus persicae. Compared to mock-inoculated plants, feeding behaviour was altered similarly on CM- and JI-infected plants, but only aphids on JI-infected plants had reduced fecundity. To evaluate the role of the multifunctional CaMV protein P6-TAV, aphid feeding behaviour and fecundity were tested on transgenic Arabidopsis plants expressing wild-type (wt) and mutant versions of P6-TAV. In contrast to viral infection, aphid fecundity was unchanged on all transgenic lines, suggesting that other viral factors compromise fecundity. Aphid feeding behaviour was modified on wt P6-CM-, but not on wt P6-JI-expressing plants. Analysis of plants expressing P6 mutants identified N-terminal P6 domains contributing to modification of feeding behaviour. Taken together, we show that CaMV infection can modify both aphid fecundity and feeding behaviour and that P6 is only involved in the latter.     

大肠杆菌多基因共表达策略

利用基因工程手段实现多个基因在同一宿主菌中共表达是大肠杆菌细胞发育调节研究和代谢途径改造的有效手段。介绍了单一转录单元的多基因共表达载体、多重转录单元的多基因共表达和单基因载体的构建原理、特点、优势及转化策略,并着重介绍了利用LIC衔接子实现基因在多基因载体上定位连接的原理和方法。     

Heterorhabditis bacteriophora as a vector for introducing its associated bacterium into the hemocoel of Galleria mellonella larvae

The nematode Heterorhabditis bacteriophora serves as a vector enabling its bacterial associate to reach the hemocoel of its host, the seventh-instar larva of Galleria mellonella. At 28.5°C, the LD₅₀s of the orally introduced nematode-bacterial complex and the intrahemocoelically injected bacteria are three to six nematodes and one to two cells, respectively.     

R~3中的一类拟齐次向量场的性质

利用三维拟齐次向量场和三维齐次向量场之间的等价关系并借鉴对齐次向量场的研究方法,把齐次向量场的一些结论推广到拟齐次向量场.并运用这些理论分析了具有不同增长率的三种群竞争模型的动力学性质和生物意义,得到增长率最大的种群在此竞争系统中占优,增长率最小的种群在此竞争系统中灭绝的结论.     

HIV-1载体的研发沿革

自从科学家于1983年发现了人类免疫性缺陷病毒1(human immunodeficiency virus1,HIV-1)以来,随着对它的研究不断深入,其表达载体的开发也有了长足的进步。与其他逆转录病毒载体相比,如莫罗尼小鼠白血病病毒(murine leukemiavirus,MLV)载体和泡沫病毒(foamyvirus,FV)载体等,HIV-1载体具有诸多独特的优点,因而有着更广泛的应用于临床基因治疗的前景。该文对HIV-1载体的研发过程及其优缺点进行综述。     

植物病毒载体在植病互作研究中的应用

在植物与病原菌互作的研究中,植物抗性基因和病原菌无毒基因的研究是两个重要的热点。利用植物病毒沉默载体构建的VIGS(Virus Induced Gene Silencing)体系研究植物的防御机制;利用植物病毒表达载体克隆和研究病原菌的无毒基因,将使我们更深刻地理解植物和病原菌互作的分子机理,最终为培育番茄白粉病持久抗性品种打下理论基础。对植物病毒载体的研究进行了综述并就我们承担的课题进行了讨论。     

病毒载体与造血干细胞基因治疗

多种获得性和遗传性疾病累及造血细胞。造血干细胞是人类基因治疗的重要靶细胞。成功的造血干细胞基因治疗不仅需要高效基因转移,还需要治疗基因的长期、高水平表达。反转录病毒载体是造血干细胞基因治疗的常用载体,结合优化的造血干细胞转导条件,其介导的腺苷脱氨酶缺陷引起的严重联合免疫缺陷和X染色体连锁的严重联合免疫缺陷的基因治疗已经获得初步成功;其他整合型病毒载体如慢病毒和腺相关病毒载体,也在临床前造血干细胞基因治疗研究中得到广泛应用。从病毒载体、基因转移和基因表达等几个方面综述了造血干细胞基因治疗的临床前和临床研究的重要进展。     

Polymer‐coated viral vectors: hybrid nanosystems for gene therapy

The advantages and critical aspects of nanodimensional polymer‐coated viral vector systems potentially applicable for gene delivery are reviewed. Various viral and nonviral vectors have been explored for gene therapy. Viral gene transfer methods, although highly efficient, are limited by their immunogenicity. Nonviral vectors have a lower transfection efficiency as a result of their inability to escape from the endosome. To overcome these drawbacks, novel nanotechnology‐mediated interventions that involve the coating or modification of virus using polymers have emerged as a new paradigm in gene therapy. These alterations not only modify the tropism of the virus, but also reduce their undesirable interactions with the biological system. Also, co‐encapsulation of other therapeutic agents in the polymeric coating may serve to augment the treatment efficacy. The viral particles can aid endosomal escape, as well as nuclear targeting, thereby enhancing the transfection efficiency. The integration of the desirable properties of both viral and nonviral vectors has been found beneficial for gene therapy by enhancing the transduction efficiency and minimizing the immune response. However, it is essential to ensure that these attempts should not compromise on the inherent ability of viruses to target and internalize into the cells and escape the endosomes.     

Synthesis of diamine maleyl chitosans, and in vitro transfection studies

Three novel diamine-modified chitosan derivatives were synthesized from N-maleyl chitosan via Michael addition reaction with 1,2-diaminoethane, 1,4-diaminobutane, and 1,6-diaminohexane, respectively. These chitosan derivatives exhibited well binding ability of condensing plasmid DNA to form complexes with size ranging from 150 to 500 nm when the chitosan derivative/DNA weight ratios were above 10. The complexes observed by scanning electron microscopy (SEM) exhibited a compact and spherical morphology. The cytotoxicity of the chitosan derivatives presented a dependence on their side-chain structures. The gene transfection experiments were evaluated in 293 T and HeLa cells. The data obtained demonstrated that the gene transfection efficiencies of these chitosan derivatives were better than that of chitosan, suggesting these chitosan derivatives as potential gene vectors in vitro.