几种IgG提纯方法的抗体活性回收率和纯度

<正>缓冲液和一般方法 磷酸盐缓冲液为100mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液,pH7.7。磷酸盐缓冲液(A)为10mM氯化钠,10mM磷酸钠缓冲液,pH6.8。正常血清缓冲液为磷酸盐缓冲液中含1:6(v/v)正常山羊血清,0.1％聚氧乙烯十二烷基醚(Brij 35)。蛋白质浓度以牛IgG作为标准溶液用计算280nm(E280)的消光值求得。     

哺乳类基因工程的一些实验操作 实验7 放射性同位素标记DNA探针

一、切[3移位（Nick translation)标记 DNAI. 配制试剂(1) 10XNT（切口移位）缓冲液：50mMMgCI21 0.1M R-M,基乙醇10.5m Tris·HCI pH7.8/0.，毫克1 毫升小牛血清白蛋白。 (2)2XAct缓冲液：20tnM Tris·HCl PH7.5/ JOmM MgCI,/2毫克/ 升小牛血清白蛋白。 (3) 1:4000 DNasel ＾液：1毫克DNase I/ I,升lomm HCI. B液：取人液5微升，加2XAc。液22.5微升和双 重蒸馏水22.5微克， 终体积为50微升（DNase I 1:10)0 取B液1.25微升，加498.75微升2 X Act缓冲 液。终体积为500微升（DNase 11:4000)a (4) dATP, dTTP, dCTP和dGTP各用重蒸水 配成2mM。体积1毫开。 2． 标记放射性同位素的反应按下列次序在 Eppendorf离心管中加入试剂：DNA探针（0.1-1.0 微克）z微升；IOXNT缓冲液2.5微升；dATP 1.5 微升；dG'TP 1.5微升；dTTP 1，，微升；ddH,0 y微 升；。一，'P-dCTP (3,000居／米摩(mmol), 10微居／微 米）5微升；DNase I (1:4 , 000)Ci/mmol, 0.5-1微 升。使总体积为25微升。置冰上1小时，加DNA多 聚酶I，单位，14℃水浴1-1.5小时，加0.2M EDTA 2.5微升终止反应。     

实验15 DNA介导转移基因(DMGT)

1.配制试剂 100×磷酸缓冲液:Na_2HPO_4·7H_2O 0.49克。NaH_2PO_4·H_2O 0.7克,溶于100毫升水中,过滤除菌。—20℃贮存。Hepes缓冲液:Hepes(50mM)1.19克(分子量为238.3),NaCl(280mM)1.64克,溶于水中,用1N NaOH调节pH为7.05—7.10,加水至100毫升,过滤除菌。—20℃贮存。     

实验12 cDNA文库的简易构建法

一、合成cDNA单链 1.按照实验3的操作程序,从哺乳类细胞中抽提poly(A)~+mRNA。 2.建立合成cDNA单链的反应系统:50mM Tris·HCI pH8.3(42℃时测定pH值);10mM MgCl_2;10mM DTT;4mM焦磷酸钠;1.25mM dGTP;1.25mM dATP;1.25mM TTP;0.5mM dCTP;15—20μCi α-~32P-dCTP(3000 Ci/mmol);100微克/毫升oligo(dT_12-18);150微克/毫升 Poly(A)~+mRNA;3000单位/毫升反转录酶,用水调节至最终体积为20或40微升。43℃保温30分钟。     

鹰嘴豆铁蛋白提取工艺优化研究

本研究以鹰嘴豆为原料,研究了缓冲液种类、缓冲液pH值、料液比、盐析盐种类、盐浓度等因素对鹰嘴豆铁蛋白提取率、总蛋白提取率及干重的影响。在单因素实验的基础上,以L9(34)正交实验方法优化鹰嘴豆铁蛋白提取工艺。结果表明:各因素对鹰嘴豆铁蛋白提取率的影响顺序依次为:料液比盐浓度温度pH。最优提取工艺为:料液比1∶4,浓度为70 mmol/L MgCl2盐析,温度50℃,KH2PO4-NaOH缓冲液pH 7.5,最优提取率为0.002643%。     

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)可溶性蛋白毛细管电泳分离

目的建立毛细管电泳技术分离分析盐生杜氏藻(Dunaliella salina)可溶性蛋白的方法.方法河北永年石英毛细管柱57cm i.d×75μm o.d;有效长度50cm.运行缓冲液50 mmol*L-1 pH7.2磷酸缓冲液;分离电压20KV;运行温度20°C;分离时间20min;检测波长280nm;压力进样,5MPa×10s.结果所建立的毛细管分离分析方法将10多种盐生杜氏藻可溶性蛋白有效分离,迁移时间及峰高重现性分别小于2%及10%.结论所建立的毛细管分离分析方法简单、方便价廉和快速.     

激素和活性多肽

921338盆组组缅生长激紊的大规模一提纯和再折扭〔英〕/Sugimoto,5.…了Agrie Biol.Chem。一1991,55(6)一1635~1637[译自DBA,1991,10(15),91一10383〕 在Manton Gaulin均化器中搅匀含有细鳗重组生长激素(rEST)的大肠杆菌细胞折射体。在s000rPm下离心匀浆(40min),用IM蔗糖洗涤片状沉淀物,然后用4%TritonX一100、20 mM磷酸缓冲液和1 mM EDTA(P H7.2)使之溶解,从而产生折射体。用6M盐酸服、50 mM Tris-HCI和0.005%吐温50(pHs.0),于4℃下搅拌2小时,溶解折射体,然后经离心(80oorpm、40m她)回收之。为使rEST分子再折叠,用10皿MTris…     

乌鳢鱼肌肉细胞线粒体DNA的纯化及电镜观察

有关乌鳢鱼(Ophiocephalusargus)线粒体DNA的研究国内尚未见报道。我们用肌肉细胞为材料,对鱼类线粒体DNA进行了研究,现介绍于下。材料与方法一、线粒体的制备(参考曹新文等,1985)取乌鳢鱼肌肉100克,用缓冲液A[0.25M蔗糖—0.15MKCl—10mMTris-HC1(pH7.5)—1mMEDTA]洗涤三次,剪碎后加10倍体积的缓冲液A用组织捣碎机捣碎,每次30秒,共捣六次,用单层纱布过滤。以上操作均在冰浴中进行。滤液于1,000×g离心20分钟(4℃),弃去沉淀,上清液于20,000×g离心20分钟(4℃)。沉淀用20倍体积的缓冲液B(0.25M蔗糖-10mMTris-HCl(pH7.5)-lmMEDTA…     

Biochemical Characterization of Soluble Acid and Alkaline Invertases from Shoots of Etiolated Pea Seedlings

Soluble invertase was purified from pea(Pisum sativum L.) by sequential procedures entailing ammonium sulfate precipitation,DEAE-Sepharose column,Con-A-and Green 19-Sepharose affinity columns,hydroxyapatite column,ultra-filtration,and Sephacryl 300 gel filtration.The purified soluble acid(SAC) and alkaline(SALK) invertases had a pH optimum of 5.3 and 7.3,respectively.The temperature optimum of two invertases was 37 ℃.The effects of various concentrations of Tris-HCl,HgCl2,and CuSO4 on the activities of the two purified enzymes were examined.Tris-HCl and HgCl2 did not affect SAC activity,whereas 10 mM Tris-HCl and 0.05 mM HgCl2 inhibited SALK activity by about 50%.SAC and SALK were inhibited by 4.8 mM and 0.6 mM CuSO4 by 50%,respectively.The enzymes display typical hyperbolic saturation kinetics for sucrose hydrolysis.The Kms of SAC and SALK were determined to be 1.8 and 38.6 mM,respectively.The molecular masses of SAC shown by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting were 22 kDa and 45 kDa.The molecular mass of SALK was 30 kDa.Iso-electric points of the SAC and SALK were estimated to be about pH 7.0 and pH 5.7,respectively.     

高粱和小麦叶片苹果酸酶某些特性比较

比较高粱和小麦叶片的苹果酸酶的某些特性。发现高粱苹果酸酶对NADP-是专一的,未观测到NAD-苹果酸酶的活力。高粱叶片的NADP-苹果酸酶的最适pH随底物浓度不同而异;在0.5 mM苹果酸浓度下酶的最适pH是7.0～7.5,在1 mM和10 mM浓度下最适pH各为7.5～8.0和8.0～8.5,其中以底物浓度10 mM的活性最高。小麦苹果酸酶也具有类似的效应;但与高粱相比较活性较低。两种不同来源的苹果酸酶在动力学特性上有明显的差异,小麦叶片NADP-苹果酸酶的Km(苹果酸)值1.3比高粱大3.4倍。pH、Mg~(++)、Mn~(++)和苹果酸对高粱叶片NADP-苹果酸酶活力具有不同程度的调节作用;在不同pH条件下Mg~(++)、Mn~(++)对高粱叶片NADP-苹果酸酶表现出不同程度的协同性。Mg~(++)、Mn~(++)的亲和力随pH的升高而增大。而对小麦叶片NADP-苹果酸酶活性几乎无多大影响。在我们所试验的浓度下乙酰辅酶A、甘氨酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖1-6二磷酸、琥珀酸以及延胡索酸对高粱NADP-苹果酸酶活性无影响。     

生物固氮

921005盐胁迫对首落根瘤菌中结瘤基因表达及首指幼苗释放诱导化合物的影响〔会,英刀Benct,G.一/5 th Internatl.Cong.Nitrogen Fixation。竺1990,5.Abs一B一06 盐度对首稽与首指根瘤菌(R瓜:。沉。哪。。沉-zot灼共生作用的影响是在共生建立的早期阶段。nod ABC的转录是用R.oel云lot艺1021菌株中质粒pRmM57上nodC一laeZ触合的介gal转录活性测定的。低盐(约100mM NaCI)抑制首稽结瘤,但不影响nodC一lacZ转录。盐度水谁达250mM不影响不同生长时期细菌的nod基因转录。在测定介质盐度达300 mM时,抑制nodC一laeZ表达50%,测定了4个不同品…     

一种快速提取丝状真菌染色体DNA的方法

介绍了一种适用于丝状真菌染色体DNA大片段的快速提取方法,该方法以(100mM Tris,100mM NaGl,50mM EDTA-Na2 2%SDS,pH值9.0)为提取液,经石英砂研磨破壁.应用该方法成功地提取了粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和头孢霉菌(Cep- halosporium sp.)等4种不同丝状真菌的染色体DNA大片段,且所提DNA片段均大于20kb,可直接用于限制性酶切、PCR等分子生物学研究.     

研究有机缓冲剂用于耐酸根瘤菌选择

五种缓冲剂对根瘤菌生长的酵母汁—阿拉伯糖—半乳糖培养基(YAG)低pH的缓冲作用进行了测定。30.7mM2[N-吗啉]乙醇磺酸(MES)具有维持pH(5.5或4.9)基本不变的缓冲能力,且根瘤菌数从10~(3-4)增加到10~9/ml.适用于耐酸的花生、大翼豆快生型根瘤菌选择。30mM的其它缓冲剂与慢生型根瘤菌的耐酸能力测定结果指出:苯甲酸(BA)pH6.0抑制根瘤菌生长;琥珀酸(SA)、柠檬酸(CA)pH变化较大;邻苯二甲酸氢钾(PHP)虽然在pH5.52条件下具有强的缓冲能力,且能区分菌株的生长差异,但在更低pH(4.5以下)条件下,则使根瘤菌生长受到抑制。     

生物膜能量偶联 ATP 酶的研究:鼠肝线粒体 ATP 酶(F_1)的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP 酶(F_1)在1MKCl-TEA 缓冲液(Tris-SO_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP 水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH 中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH 基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu 膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP 酶水解活力和对DCCD 的敏感性。     

生物膜能量偶联ATP酶的研究:鼠肝线粒体ATP酶(F_1)~*的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP酶(F_1)在1MKCl-TEA缓冲液(Tris-So_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2 mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP酶水解活力和对DCCD的敏感性。     

姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是蛋白质研讨班的学员,实验中有个问题向您请教。用硫酸铵沉淀镍柱亲和纯化的蛋白溶液后,用20mM PBS(pH6.8)复溶,接着用G25 5ml预装柱在AKTA纯化仪上脱盐,缓冲液为20mM PBS(pH6.8),出现了两个几乎等高的UV峰。第一个峰先于电导峰,第二个峰与电导峰重叠,SDS-PAGE显示两个峰均为目的蛋白(57kDa),而且4℃放置过夜之后,两个峰对应的溶液变浑浊。请您指点!     

用自旋标记研究嗜盐菌紫膜的相变

本文用5′酮基软脂的甲酯的N′氧基4、4-二甲基(口恶)唑衍生物、TEMPO和4-(乙氧基氟代磷酸))-TEMPO′研究了嗜盐菌紫膜的相变.ESR测定表明:在醋酸钠缓冲溶液中(100mM、pH7.0)、30至70℃没有观察到相转变;在81℃附近获得了紫膜类脂的另一相变点,此转变点可能与紫膜类脂及蛋白质晶格的分离有关.紫膜蛋白质的热变性点则在100℃附近.当温度升至110℃时紫膜类脂烃链则趋“熔化”,紫膜蛋白质的热变性也呈不可逆的.文中还就不同的物理因素对紫模相变的影响进行了讨论.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯和性质的研究

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)209产生的胞外碱性蛋白酶的粗酶制剂(5×10 4u／g),经硼砂NaOH缓冲液抽提,硫酸铵沉淀,Sephadex G一25脱盐,DEAE-纤维素柱层析,冷冻干燥获得部分纯化的酶。纯酶的活力为199x10u/g,比活力提高2,6倍。此酶的最适pH8．5—9．0,在pH6一10之间稳定,因此是属于微碱性蛋白酶“’。最适温度为50℃,在50℃以下稳定,在60℃处理10分钟活力损失95％。0.003村c丑件的存在对酶的热稳定性和pH稳定性均有显著提高。Ag+,Cu2+,Fe2+,Hg+,Zn2+ 对酶有抑制作用;Mn2+有明显的激活作用;1×10-3M的PCMB,IAA,O-PTH,PMSF对活力无影响;1×10-3M EDTA对酶有30％的抑制作用;在40℃用NBS(1×10-4M)、DFP(2．5mM)对醢进行10分钟处理,酶活力完全损失。此酶能水解多种天然蛋白,如酪蛋白、血红蛋白、蛇毒蛋白等,不水解鱼精蛋白和溶菌酶。以酪蛋白为底物测得的km值为0．66×10-2g／ml。在pH7．3进行圆盘凝胶电泳,虽然呈现九条带,但均具有大小不等的蛋白酶活力。     

电激作用引起的嗜热链球菌的遗传转化

至今还没有适于嗜热链球菌的转化系统,并且也难以使该菌的原生质体再生。因此,对电激法作为另一种把 DNA 引入该菌的转移方法作了试验。把对数中期的嗜热链球菌悬浮在含有0.3M棉子糖、7 mM 磷酸钾和1 mM 氯化镁的缓冲液(pH7.4)中,该液同时含有10μg的携带红霉素抗性标记的链球菌克隆载体 pV736的 DNA。在2000伏的电压下和4.5毫秒的时间内完成电激反应,然后将此细胞悬浮液在4℃下保持30分钟。接着把20μg/l 的红霉素沉积在乳糖琼脂培养基上。这种方法的转化水平不高(每μg DNA 约获得10个转化子),也不能     

鼻咽癌转移淋巴结中EB病毒相关的DNA多聚酶的分离及其特性研究

一种新的DNA多聚酶已从鼻咽癌(NPC)转移淋巴结胞核酶液,通过DEAE-纤维素柱层析而被部分纯化,并可与细胞的α-及β-DNA多聚酶分开。 此酶有下列特点可与细胞DNA多聚酶区分:(1)可放DEAE-纤维素吸附,需用130mMK_2HPO_4缓冲液方可洗脱下来。(2)可被浓盐所激活,150——200mMKCl或75mM(NH_4)_2SO_4可使它显示最高的酶活性。(3)最适pH为8.0。(4)对磷酰甲酸盐的抑制较敏感。(5)能很好地利用某些合成模板,如poly(dA)·oligo(dT)_(10)及poly(dA)·oligo(dT)_(12-18)。但不能利用poly(rA)·oligo(dT)_(10),证明此酶并非细胞的γ-DNA多聚酶,而与巴基特淋巴瘤的EB病毒相关的(EBV)DNA多聚酶性质十分相似。对照的Raji细胞未见此种EBV-DNA多聚酶。 从鼻咽癌淋巴结中分离出此种EBV-DNA多聚酶,将对EB病毒与NPC的发病关系提供新的证据。