棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达分析

【目的】通过对棉铃虫Polycalin基因的克隆及其表达谱分析,进一步明确Polycalin基因在抗性中发挥的作用,为棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性治理提供理论依据。【方法】通过RACE结合PCR技术克隆获得了棉铃虫Polycalin基因的全长序列,利用实时荧光定量PCR技术测定了在棉铃虫不同发育时期、幼虫肠道不同部位的Polycalin基因表达量,比较了棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料后,Polycalin基因表达量的变化。【结果】该基因全长序列为2 955 bp,开放阅读框为2 781 bp,编码926个氨基酸(Gen Bank登录号为KP100652);预测蛋白的分子量为101.68 ku,等电点为4.57。推导的氨基酸序列中,N末端含有20个氨基酸组成的信号肽,含有8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,C末端存在2个GPI结合位点。Polycalin在棉铃虫所有发育阶段都可以表达,幼虫期表达量较高,尤其在1~3龄幼虫体内表达量最高,在卵、成虫和蛹中的表达量较低。棉铃虫4龄幼虫取食含活化Cry1Ac蛋白的人工饲料后,Polycalin基因的表达受到抑制。【结论】研究结果可以为进一步揭示Polycalin基因的功能及其在Bt杀虫机制中的作用奠定基础。     

Cry1A毒素与二化螟中肠刷状缘膜囊泡受体蛋白配基结合分析

分离和鉴定二化螟Chilo suppresalis幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）中Cry1A毒素的受体蛋白,对于阐明Cry1A毒素作用机理和二化螟抗性机理具有十分重要的意义。为此,本文就Cry1A毒素对二化螟杀虫活性及Cry1Ac与二化螟中肠受体的配基结合进行了研究。结果表明: Cry1Ab对二化螟室内品系(CN)的毒力高于Cry1Ac,而Cry1Ac高于Cry1Aa。配基结合分析表明二化螟CN品系幼虫中肠BBMV中有6个Cry1Ac结合蛋白(分子量分别为50,70,90,120,160和180 kDa), 其中180,160和90 kDa结合蛋白的条带颜色明显深于其他结合蛋白的条带,表明这3个受体蛋白具有较高的结合浓度。同源竞争结合研究表明,180和90 kDa结合蛋白为Cry1Ac的低亲合性结合蛋白,其他4个为高亲合性结合蛋白。为了研究Cry1Ac和Cry1Ab受体结合部位的相互作用,进行了异源竞争结合研究。Cry1Ab可以与Cry1Ac所有的6个结合蛋白进行竞争性结合,与180,120,70和50 kDa结合蛋白具有高亲合性,而与160和90 kDa结合蛋白具有低亲合性。结果显示,Cry1Ac与Cry1Ab在二化螟幼虫中肠BBMV上拥有多个共享的结合位点,但对每个结合位点的亲合性有差异。基于毒素结合部位的相似性,Cry1Ac和Cry1Ab不宜同时用于转基因Bt水稻来控制二化螟。     

棉铃虫中肠氨肽酶APN4与Cry1Ac、Cry2Aa结合能力的比较

【目的】Bt杀虫蛋白(Bacillus thuringiensis)具有高度的靶标特异性,已经被广泛用于农业害虫防治。Bt杀虫蛋白要发挥杀虫活性,必须首先与其受体蛋白结合,氨肽酶N(Aminopeptidase N)是一类重要的Bt受体蛋白。因此,分析该受体与Bt杀虫蛋白的结合能力,可为进一步明确不同Bt的分子作用机制、Bt的抗性治理以及新Bt的开发应用等提供借鉴。【方法】本文利用Ligand blot和Elisa方法比较了棉铃虫Helicoverpa armigera中肠APN4(Aminopeptidase N4,APN4)与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力。【结果】原核表达的APN4片段与活化的Cry1Ac、Cry2Aa都可以结合,解离常数(Kd)分别是48.59 nmol/L和21.73 nmol/L。【结论】APN4片段与Cry1Ac、Cry2Aa的结合能力在数量级上不存在显著性差异。     

棉铃虫ABC转运蛋白ABCG1的基因克隆、亚细胞定位及其与Cry1Ac毒力的关系

【目的】长期种植转Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物使一些靶标害虫产生了Bt抗性,有研究表明小菜蛾Plutella xylostella的white基因表达下调使其产生了Cry1Ac抗性,由于Pxwhite蛋白与ABC转运蛋白ABCG1同属于ABCG亚家族,我们推测棉铃虫Helicoverpa armigera ABCG1基因(HaABCG1)的表达下调可能与棉铃虫对Cry1Ac毒素的抗性有关。【方法】克隆并分析HaABCG1的开放阅读框(open reading frame,ORF),通过构建HaABCG1基因的表达载体检测HaABCG1蛋白在TnH_5细胞中的亚细胞定位;通过细胞毒力实验验证HaABCG1蛋白与Cry1Ac毒素的关系;利用RNAi技术验证HaABCG1表达下调是否会降低棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性。【结果】棉铃虫ABCG1基因的开放阅读框长1 896 bp,编码蛋白含631个氨基酸残基,分子质量估计为69.63 k D。离体昆虫细胞表达的HaABCG1蛋白主要定位在细胞的核膜和内质网。通过RNA干扰和生物测定实验发现HaABCG1下调表达不能使棉铃虫在Cry1Ac毒素浓度为0.05μg/m L的人工饲料上正常生长,3 d后处理组和对照组棉铃虫幼虫的体重变化无显著差异。经过细胞毒力实验证明HaABCG1蛋白不介导Cry1Ac毒素对TnH_5细胞的毒力,它既不是Cry1Ac毒素的受体,也不是其他3种Bt毒素Cry1Ca,Cry2Aa和Cry1Fa的受体。【结论】HaABCG1基因表达下调与棉铃虫对Cry1Ac的抗性不相关,HaABCG1不是Cry1Ac毒素的受体。这是首次报道ABCG1基因不参与棉铃虫的Cry1Ac抗性。     

小分子热激蛋白基因HaHSP19.8在棉铃虫抗逆反应中的作用

【目的】小分子热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)在昆虫抵御外界环境压力中至关重要。本研究旨在探究小分子热激蛋白sHSP19.8基因在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育、抵御高温胁迫和对Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制中的作用,为更深入探析该基因作用机理及棉铃虫的防治奠定基础。【方法】通过PCR结合RACE克隆棉铃虫sHSP19.8基因序列,利用生物信息学软件对该基因序列进行分析;通过qRT-PCR测定Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫在40℃高温下处理1 h和2 h及饲喂含30 μg/mL Cry1Ac的人工饲料1 h和2 h后该基因的表达量,并测定抗感Cry1Ac棉铃虫不同发育阶段(1-5龄幼虫、蛹及成虫)和5龄幼虫不同组织(前肠、中肠、后肠、马氏管及表皮)中该基因的表达模式。【结果】获得了棉铃虫sHSP19.8基因的全长cDNA序列,命名为HaHSP19.8(GenBank登录号: XP_021195228.1),长608 bp,开放阅读框长528 bp,编码175个氨基酸残基,具有小分子热激蛋白的典型α-晶体结构域(α-crystallin domain, ACD)。该基因受40℃高温和30 μg/mL Cry1Ac杀虫蛋白诱导时在Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫中均过量表达;在Cry1Ac敏感棉铃虫整个发育阶段和5龄幼虫各组织中均表达,其中在成虫和5龄幼虫以及5龄幼虫表皮、马氏管和中肠内表达量较高;但是该基因在Cry1Ac抗性品系各个发育阶段和5龄幼虫各组织中表达量相比敏感品系都显著较低。【结论】结果说明HaHSP19.8参与棉铃虫生长发育和生理生化的过程,帮助昆虫抵御外界环境压力,并可能参与到棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制中。     

RNAi介导的棉铃虫氨肽酶N基因Haapnl和钙粘蛋白基因Ha_BtR沉默对Cry1Ac毒力的影响

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)和钙粘蛋白(cadherin)是存在于鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles,BBMV)上Bt毒素Cry1A的受体.本实验将棉铃虫Helicoverpa armigera氨肽酶N1基因Haapnl和钙粘蛋白基因Ha_BtR双链RNA(dsRNA)注入棉铃虫4龄幼虫体内,以研究这两种受体基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响.结果表明:注射dsRNA(1 μg/头)进行基因沉默后,Haapnl mRNA表达量比注射缓冲液(elution solution,ES)的对照下降了30%～49%,Ha_BtR mRNA表达量下降了30%～37%.注射Haapnl dsRNA的幼虫在40和70 μg/cm2 Cry1Ac活化毒素下的死亡率显著低于注射ES的幼虫,而在100和170 μg/cm2 Cry1Ac原毒素处理下两者死亡率无显著差异;Cry1Ac活化毒素以及原毒素对注射Ha_BtR dsRNA幼虫与注射ES幼虫的毒力均无显著差异.当同时注射Haapnl及Ha_BtR dsRNA后,干扰后的幼虫对Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均显著下降.本研究进一步证明了棉铃虫Haapnl和Ha_BtR均是Bt毒素Cry1Ac的功能受体,这两种受体蛋白共同参与Cry1Ae的毒杀作用过程.该结果也提示.Haapnl或Ha_BtR基因产生突变都可能导致棉铃虫对CrylAc产生抗性.     

二化螟钙黏蛋白CAD1的原核表达及与Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的结合

【目的】二化螟是水稻的重要害虫之一,钙黏蛋白(cadherin,CAD)是一类重要的Bt杀虫蛋白受体,在获得二化螟钙黏蛋白基因(Cs CAD1)的基础上,明确Cs CAD1蛋白与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力。【方法】利用PCR技术克隆Cs CAD1基因片段,将构建的p ET-28a-(+)-Cs CAD1重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳检测,利用western blot和ligand blot技术分析其与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力。【结果】重组载体可在表达菌株BL21中表达一个约44 ku的蛋白,原核表达载体构建成功。SDS-PAGE显示该蛋白条带单一,且纯度较好。Ni柱亲和层析纯化该目的蛋白后进行Ligand blot分析,结果显示Cs CAD1重组蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合。【结论】Cs CAD1蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合,是潜在的Cry蛋白受体,所得结果有助于阐明Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对二化螟的作用机制。     

棉铃虫中肠钙粘蛋白基因的克隆、表达及Cry1A结合区定位

钙粘蛋白是动物糖蛋白的一个家族, 在细胞与细胞间粘附过程中起着重要作用. 最近的研究表明, 昆虫中肠膜上的钙粘蛋白是Bt毒素Cry1A的受体, 它的变异与昆虫对Bt产生抗性有关. 通过简并引物PCR扩增结合RACE技术克隆了编码棉铃虫中肠钙粘蛋白的完整cDNA序列, 该cDNA全长5581 bp(已经在GenBank中登记, 序列号为AF519180), 编码1730个氨基酸, 预测分子量和等电点分别为195.39 kD和4.23. 推导的氨基酸序列包括一个信号肽、一个前蛋白区、11个钙粘蛋白重复、一个靠近细胞膜的区域、一个跨膜区和细胞质内部分. 序列比较结果表明, 推导的氨基酸序列与烟蚜夜蛾钙粘蛋白氨基酸序列同源性最高, 达到84.2%; 与家蚕、烟草天蛾和棉红铃虫的钙粘蛋白氨基酸序列同源性分别为60.3%, 57.5%和51.0%. 用PCR方法获得了不同大小的钙粘蛋白基因片段, 缺失体表达和配体结合试验表明, 重组钙粘蛋白能与Cry1Ac发生结合, 结合区位于第1217～1461位的244个氨基酸组成的肽链上. 半定量RT-PCR结果表明, 钙粘蛋白主要在棉铃虫中肠表达, 在前肠和后肠表达量很低, 在肠道以外的组织中不表达. 棉铃虫对Cry1Ac产生抗性后, 钙粘蛋白的表达量明显降低. 证实了棉铃虫中肠钙粘蛋白是Bt毒素Cry1Ac的受体, 并且将钙粘蛋白与Cry1Ac结合的区域定位到244个氨基酸组成的肽链上, 推测钙粘蛋白表达量降低是棉铃虫对Cry1Ac产生抗性的主要原因之一. 以上研究对于明确棉铃虫对Bt产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测田间抗性基因的频率具有非常重要的意义.     

不同Bt蛋白对棉铃虫存活率和生长发育的影响

【背景】在我国Bt棉主要以Cry1Ab或Cry1Ac为主,其他新型Bt基因未被转入棉花中用来控制害虫,然而大面积种植单价Bt基因的棉花,将可能会大大增加靶标害虫对该类型Bt棉花抗性频率,因此研究其他新型Bt蛋白对靶标害虫的控制作用显得十分必要。【方法】采用蛋白混入人工饲料的生物测定方法,在室内测定了6种Bt蛋白对棉铃虫初孵幼虫的毒力,比较了浓度为1.0μg·g-1时不同Bt蛋白对棉铃虫幼虫生长发育的影响。【结果】毒力测定结果表明,不同Bt蛋白对棉铃虫初孵幼虫的毒力不同,LC50值由低到高依次为Cry1Ab 0.065μg·g-1、Cry1Ac 0.074μg·g-1、Cry2Ab 0.133μg·g-1、Cry2Aa 11.670μg·g-1、Cry1Ah 13.010μg·g-1和Cry1Ca20μg·g-1。生长发育测定结果表明,Cry1Ab和Cry1Ac对棉铃虫幼虫的生长发育影响最大,Cry2Ab次之;Cry1Ah和Cry2Aa对1龄幼虫的校正死亡率和体重抑制率差别不大,但对2龄幼虫的差异较大,Cry1Ah处理2龄幼虫后体重和生长发育参数与Cry2Ab接近,而Cry1Ca对棉铃虫幼虫生长发育几乎没影响。【结论与意义】Cry1Ah、Cry2Aa和Cry2Ab的毒力不如Cry1Ac和Cry1Ab,但仍可以作为控制棉铃虫幼虫的替代策略。     

棉铃虫中肠钙粘蛋白、氨肽酶N及碱性磷酸酯酶的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响

【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了棉铃虫Helicoverpa armigera的BBMV,制备了钙粘蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)和碱性磷酸酯酶(ALP)3种受体蛋白的抗体和抗血清;然后,利用Western blot检测BBMV上这3种受体蛋白后,利用抗体封闭技术比较了敏感棉铃虫和Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中3种受体蛋白的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响。【结果】对敏感品系棉铃虫,这3种已知的Cry1Ac受体蛋白抗血清显著地降低了Cry1Ac和Cry2Aa的毒力。其中APN抗血清对Cry1Ac毒力的影响最大,棉铃虫幼虫的死亡率降低了84.44%;ALP抗血清对Cry2Aa的毒力影响最大,棉铃虫幼虫死亡率比对照降低了71.04%。Cry1Ac对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力显著降低,Cry2Aa的毒性也减弱。在Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中,3种受体抗血清对Cry1Ac的影响比在敏感棉铃虫中的影响小,尤其是CAD和APN抗血清对Cry1Ac毒力的抑制率显著低于在敏感棉铃虫中的抑制作用;CAD和ALP抗血清对Cry2Aa毒力的影响与在敏感棉铃虫中的影响差异不显著,但APN抗血清可以显著降低Cry2Aa对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力。【结论】棉铃虫CAD,APN和ALP不仅参与了Cry1Ac的杀虫过程,也对Cry2Aa毒力有一定的影响,而且这3种蛋白可能与棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Aa产生抗性及交互抗性相关。     

暗黑鳃金龟碱性磷酸酶HpALP的基因克隆、表达及其与Bt Cry8Ea3的结合特性

【目的】明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)晶体蛋白对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的杀虫机制。【方法】基于暗黑鳃金龟转录组数据,PCR克隆暗黑鳃金龟碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)基因HpALP全长cDNA序列;利用原核表达系统在体外表达HpALP,并进行Western blot检测;利用qRT-PCR测定HpALP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫不同组织(前肠、中肠、直肠、回肠、马氏管、脂肪体和体壁)中的表达水平;利用配体印记实验及ELISA技术对HpALP蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry8Ea3体外结合特性进行分析。【结果】得到了暗黑鳃金龟HpALP 全长cDNA (GenBank登录号: MZ004964),长1 536 bp,编码512个氨基酸,预测蛋白质分子量为57.32 kD,等电点为4.70;HpALP与食粪金龟Onthophagus taurus ALP的氨基酸序列一致性最高;原核表达获得重组蛋白HpALP,经Western blot检测HpALP重组蛋白在IPTG诱导8 h时的表达量最高。qRT-PCR分析的组织表达谱结果表明,HpALP在幼虫前肠中丰度最高。HpALP重组蛋白可以与Cry8Ea3特异结合,解离常数Kd值为76.21±26.44 nmol/L,最大亲合力B_max值为0.59±0.068;而HpALP重组蛋白与对照Cry1Ab35不结合,Kd值为142.50±137.30 nmol/L,Bmax值为0.013±0.005。【结论】分离鉴定了暗黑鳃金龟HpALP蛋白,它与Bt Cry8Ea3亲和力强,推断其为Cry8Ea3的受体蛋白。研究结果为明确Cry8Ea3蛋白对暗黑鳃金龟的作用机制提供了理论依据。     

桃蛀螟CYP6AE76基因参与对Cry1Ab蛋白的解毒作用

【目的】明确桃蛀螟Conogethes punctiferalis幼虫取食Cry1Ab蛋白后体内CYP6AE76的过表达及对Cry1Ab蛋白有解毒作用。【方法】分析桃蛀螟CYP6AE76序列特征;利用RT-qPCR检测CYP6AE76在不同发育阶段(1-5龄幼虫)和4龄幼虫不同组织(头、中肠、血淋巴和脂肪体)以及4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(LC₅₀=1.08 ng/cm2)的人工饲料3 d存活的幼虫中肠和血淋巴中的表达量;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟4 龄幼虫CYP6AE76后检测中肠中CYP6AE76的表达量,并统计120 h后幼虫体重并计算幼虫存活率;利用RNAi饲喂法沉默桃蛀螟初孵幼虫CYP6AE76后饲喂含1.08 ng/cm² Cry1Ab蛋白的饲料,7 d后统计幼虫体重并计算幼虫存活率。【结果】桃蛀螟CYP6AE76基因开放阅读框长1 572 bp,编码524个氨基酸,分子量约为60.34 kD,属于CYP6家族基因。发育表达谱结果表明, CYP6AE76基因在桃蛀螟整个幼虫阶段均有表达且在1龄幼虫期表达量最高,随着幼虫龄期增大而表达量降低;组织表达谱结果表明,CYP6AE76在4龄幼虫中肠中表达量最高。4龄幼虫取食含有Cry1Ab蛋白(1.08 ng/cm²)的人工饲料后,CYP6AE76在中肠和血淋巴中的表达量相比对照显著上调。通过RNAi沉默CYP6AE76后,桃蛀螟初孵幼虫再取食含有Cry1Ab蛋白的人工饲料后体重显著降低。【结论】CYP6AE76可能参与对桃蛀螟幼虫摄入的Cry1Ab蛋白的解毒。     

Cry1Ac和Cry2Ab杀虫蛋白对粘虫幼虫生长发育的影响

【目的】为探究Bt杀虫蛋白对次要靶标害虫粘虫Mythimna separata (Walker)(鳞翅目:夜蛾科)的杀虫活性及对其生长发育的影响。【方法】本文通过浸叶法饲喂初孵及2龄末粘虫不同剂量的Cry1Ac及Cry2Ab杀虫蛋白后,观察其死亡率,称量幼虫重,并统计了幼虫历期、化蛹率、蛹重、蛹期、蛹的羽化率、畸形率等指标。【结果】初孵幼虫取食浸泡含16、64、128μg/mLCry1Ac及Cry2Ab的玉米叶片后,随着时间的延长及浓度的增加,死亡率逐渐增加,且Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫的生物活性高于Cry2Ab蛋白,在128μg/mL浓度下,取食Cry1Ac和Cry2Ab蛋白13d时的死亡率分别达到了65%及60%。取食两种蛋白后,初孵幼虫和2龄末幼虫重量均受到显著抑制,短期取食两种蛋白对幼虫历期、化蛹率、蛹重、蛹期、蛹的羽化率、畸形率没有影响。【结论】取食Cry1Ac和Cry2Ab杀虫蛋白后,对初孵幼虫有很好的杀虫活性,且Cry1Ac杀虫活性高于Cry2Ab杀虫蛋白;短期饲喂两种杀虫蛋白时,对2龄粘虫后期生长影响不大。本文结果为转Bt基因作物更好的应用于粘虫的防治提供了理论基础。     

小菜蛾中肠氨肽酶基因PxAPN5的克隆、原核表达及蛋白质同源建模分析

【目的】克隆和表达小菜蛾Plutella xylostella氨肽酶基因,并进行基因序列分析和同源建模分析。【方法】以小菜蛾中肠cDNA为模板克隆分析氨肽酶基因序列, 原核表达氨肽酶蛋白并进行酶活性测定, 应用配体印迹分析氨肽酶与Cry2Ab蛋白的结合, 通过蛋白质建模对突变位点进行分析。【结果】从小菜蛾中肠cDNA 扩增出氨肽酶基因, 该基因全长2 853 bp, 编码950个氨基酸, 预测蛋白分子量为107.3871 kDa, 等电点为5.24; 进化树分析显示, 克隆得到的氨肽酶基因属于APN家族5, 将其命名为PxAPN5（GenBank登录号: KM034756）。PxAPN5蛋白具有鳞翅目昆虫氨肽酶蛋白的保守性特征, 即含有N-糖基化位点、O-糖基化位点和GPI锚定位点, 具有“HEXXH”锌蛋白酶结构域和C端跨膜区域。在大肠杆菌Escherichia coli中原核表达PxAPN5, 表达产物经SDS-PAGE电泳, 在110 kDa附近出现特异性条带; 酶活性测试显示菌体破碎上清液具有氨肽酶活性, 比活力为1 047.2 U/g。配体印迹结果显示表达的PxAPN5能与Cry2Ab蛋白特异性结合。多序列比对结果表明, 与其他已报道的小菜蛾氨肽酶相比, PxAPN5氨基酸序列有3个保守性位点发生了突变,并通过蛋白质建模的方式表征突变位点。【结论】本研究成功克隆和表达了具有氨肽酶活性的小菜蛾氨肽酶, 并发现其能与Cry2Ab蛋白特异性结合; 通过蛋白质建模对氨肽酶突变位点的特征及功能进行了预测。 这些结果对小菜蛾氨肽酶的功能性研究提供了理论基础。     

草地贪夜蛾取食Cry1Ab和Cry1Fa蛋白后中肠转录组及ABC基因表达分析

【目的】为揭示草地贪夜蛾Spodoptera furgiperda幼虫取食Bt蛋白后与中肠上相关ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette transporter, ABC)蛋白基因的表达量变化的关系。【方法】分别使用含活化晶体蛋白Cry1Ab (LC₇₀=240.2 μg/g)和Cry1Fa (LC₇₀=270.0 μg/g)蛋白的人工饲料饲喂草地贪夜蛾4龄幼虫48 h,利用高通量测序对中肠进行转录组测序并进行生物信息学分析,筛选处理后差异表达基因;利用RT-qPCR验证差异表达ABC基因的表达量。【结果】与饲喂正常人工饲料的对照相比,饲喂含240.2 μg/g Cry1Ab和270.0 μg/g Cry1Fa的人工饲料后草地贪夜蛾4龄幼虫中肠转录组中分别检测到1 305和1 202个差异表达基因。Cry1Ab和Cry1Fa处理组与对照组之间分别有994和912个差异表达基因被GO功能注释到生物学过程、分子功能和细胞组分三大类。在最终筛选到的9个差异表达的ABC家族基因中,Cry1Ab处理组与对照组之间有4个差异表达ABC基因,3个上调,1个下调; Cry1Fa处理组与对照组之间有5个差异表达ABC基因,2个上调,3个下调;Cry1Ab和Cry1Fa处理组与对照组之间有2个ABC基因(LOC118267200和LOC118267201)表达量均显著上调。RT-qPCR验证结果表明,与对照组相比,Cry1Ab处理组有3个ABC基因表达量极显著上调,2个ABC基因表达量下调;Cry1Fa处理组有5个ABC基因表达量上调,1个ABC基因表达量下调。【结论】Cry1Ab和Cry1Fa蛋白的摄入可以影响草地贪夜蛾幼虫中肠一些ABC家族基因的表达量变化,这些基因的表达量变化与昆虫抗性产生有关。经比对后发现,ABCC家族与ABCG8基因表达量变化显著。本研究为下一步明确草地贪夜蛾体内ABC转运蛋白在Bt蛋白杀虫机制中的作用,以及合理使用Bt蛋白防治草地贪夜蛾及延缓抗性提供了理论依据。     

大螟中肠氨肽酶N基因的克隆及表达谱分析

昆虫中肠氨肽酶N是Bt毒素的重要受体之一, 与Bt毒素的杀虫机制及昆虫Bt抗性的产生密切相关。本研究通过简并引物PCR结合RACE技术克隆并获得大螟 Sesamia inferens Bt受体蛋白--氨肽酶N （aminopeptidase N, APN）基因的cDNA序列全长, 经NCBI同源比对分析, 认为该基因为APN3基因, 并将其命名为SiAPN3（GenBank登录号为HQ636624）。序列分析表明, 该基因的cDNA序列全长为3 411 bp, 开放阅读框为3 018 bp, 编码1 006个氨基酸; 预测蛋白质分子量为114 kD, 等电点为4.95; 其推导的氨基酸序列中具有鳞翅目昆虫氨肽酶N典型的结构特征, 即含有1个N-和12个O-连接的糖基化位点, N-末端具有18个氨基酸的剪切信号肽, 谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN, 锌结合位点HEXXHX18E, C-末端具有22个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。采用实时定量PCR研究了SiAPN3在大螟4龄幼虫肠道不同部位和幼虫不同龄期的转录表达谱。结果表明, 该基因在幼虫中肠中的表达量最高, 其次为后肠, 前肠中表达量最低, 且中肠和后肠中的表达量显著高于前肠（P＜0.05）; SiAPN3在3龄幼虫中的表达量最高, 1龄幼虫中最低, 虽然3、 4日龄之间的表达量没有显著差异, 但二者均显著高于其他日龄, 1, 2和5日龄之间不存在显著差异（P>0.05）。该研究为阐明APN基因的功能及大螟对Bt抗性产生的分子机制奠定了基础。     

钙粘蛋白片断可使Bt毒素增效

苏云金芽胞杆菌（Bt）可以分泌产生有杀虫性的结晶状蛋白，它已被广泛地应用到农业害虫防治中，且起到了重要的作用。钙粘着蛋白Bt—R1是一种结合蛋白，存在于烟草天蛾中肠上皮细胞里，可结合BtCry1A毒素。Adang等科学家先前鉴定出Bt—R1区很接近细胞膜的CR12-MPED区（Cry1Ab介导的细胞毒素途径所必需的一个结合区）。2007年8月28日《PNAS》报道了一个含有CR12-MPED区的肽，并在大肠杆菌中表达，可作为Cry1A毒性的增效剂，防治鳞翅目幼虫。CR12-MPED肽结合在刷状缘膜囊和中肠微绒毛上，但不改变中肠上Cry1Ab或Cry1Ac结合位点。通过BIAcore分析，证明Cry1Ab可结合在CR12-MPED的高、低2个亲合位点上。     

二化螟APN1的原核表达及其与Cry2Aa蛋白的结合特性研究

【目的】Bt杀虫蛋白发挥杀虫活性的重要前提是Cry蛋白能够与昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊(BBMVs)上的受体蛋白结合。在前期获得二化螟氨肽酶N1(Aminopeptidase N,APN1)基因全长序列的基础上,明确二化螟APN1多肽片段与Cry2Aa的结合能力。【方法】将二化螟APN1序列片段在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用蛋白质单向电泳和ligand blotting技术分析二化螟APN1多肽片段与Cry2Aa的结合能力。【结果】重组载体可在表达菌株BL21(DE3)中表达一个约70 ku的蛋白,纯化后的多肽条带单一,纯度较好。Ligand blot分析结果显示,表达的二化螟APN1多肽片段可以与活化的Cry2Aa杀虫蛋白结合,且结合条带随着重组蛋白上样量的降低而减弱。【结论】APN1多肽片段可以与Cry2Aa结合,为阐明APN1基因的功能奠定基础,也为其他Bt蛋白的受体蛋白相关研究提供新的借鉴。     

PxCAD1与Cry1Ac蛋白混合物对小菜蛾生长发育及体内酶活性的影响

[目的]PxCAD1肽段可显著增强Cry1Ac的杀虫活性,探究其与Cry1Ac混合物对靶标昆虫生物学及体内酶活性的影响对明确其增效机制具有重要意义.[方法]采用叶片浸渍法,以PxCAD1肽段与Cry1Ac毒素的混合蛋白饲喂小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫,观察并统计小菜蛾死亡率、化蛹率和羽化率,并测定小菜蛾幼虫体体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、总蛋白酶和类胰蛋白酶的变化趋势.[结果]与对照相比,处理组幼虫的死亡率显著升高,化蛹率减少,羽化率显著降低;3龄幼虫在取食PxCAD1肽段与Cry1Ac毒素混合蛋白24 h和48 h后,羧酸酯酶活性显著升高,72 h显著降低,谷胱甘肽-S-转移酶活性在24 h显著升高,48 h显著降低,72 h则无显著差异,而总蛋白酶活性仅在72 h显著低于对照,类胰蛋白酶活性在各时间点无显著变化.[结论]PxCAD1不仅对Cry1Ac具有显著增效作用,同时对小菜蛾幼虫的生长发育及体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶及总蛋白酶的活性产生不利影响.该结果将有助于进一步研究中肠受体蛋白对Cry1Ac的增效机制.     

粘虫类钙粘蛋白基因的克隆、序列分析及时空表达

昆虫中肠膜类钙粘蛋白（cadherin-like protein, CLP）是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt)毒素的重要受体之一, 与Bt毒素的杀虫作用机制以及昆虫对Bt毒素的抗性等密切相关。本研究应用RT-PCR和RACE技术, 克隆了迁飞性重要害虫粘虫Mythimna separata类钙粘蛋白基因全长cDNA序列（命名为Msclp, GenBank登录号为JF951432）, 全长5 642 bp, 编码1 757个氨基酸, 推导的氨基酸序列具有昆虫类钙粘蛋白的特征结构, 包括1个信号肽、 1个前蛋白区、 12个钙粘蛋白重复、 1个近膜区、 1个跨膜区和1个胞质区。预测的分子量和等电点分别为196.786 kD和4.5。该蛋白与同科的烟夜蛾Helicoverpa assulta、 烟芽夜蛾Heliothis virescens、 棉铃虫Helicoverpa armigera及甜菜夜蛾Spodoptera exigua的类钙粘蛋白亲缘关系最近, 氨基酸序列一致性分别为61.77%, 61.66%, 61.26%和58.14%。荧光定量RT-PCR分析表明, 该类钙粘蛋白基因在不同龄期的粘虫幼虫中表达量差异极显著(P<0.01), 其中4龄幼虫相对表达量最高, 但与3龄、 6龄幼虫并没有显著性差异; 1和2龄幼虫表达量最低; 表达部位主要在粘虫中肠, 在中肠以外的虫体其他部位表达量极低。这些结果对于揭示转Bt作物对非靶标、 迁飞性粘虫的杀虫作用机制以及评价其潜在的对Bt毒素抗性机制等奠定了基础。