基于中草药活性成分的GSK-3β抑制剂的分子模拟

使用分子对接和分子动力学方法,研究了一类中草药活性成分抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的机理。结果表明:筛选出的芦丁、杨酶酮、二氢丹参酮I和人参皂苷Rb1能够与GSK-3β良好地结合,其中芦丁、杨酶酮和二氢丹参酮I主要结合于GSK-3β的ATP结合口袋区域,人参皂苷Rb1主要结合于GSK-3β的T-loop区域,配体和蛋白之间形成的氢键的数目和存活率是影响结合能力的主要因素,氢键的形成主要取决于配体中的含氧和含氮基团。基于这些有效成分进行结构设计可能获得GSK-3β的高效抑制剂。     

毁灭柱孢菌中一种人参皂苷Rb1水解酶的纯化及酶学性质研究

通过DEAE-纤维素阴离子交换层析、30％～80％（NH3）2SO3盐析、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析和Mono Q HR5／5阴离子交换层析,从毁灭枉孢菌培养液中部分纯化出一种能够水解人参皂苷Rb,的β-葡萄糖苷酶F-I。F—I具有较好的pH稳定性和热稳定性,在pH4．0～11．0范围内和55℃以下表现出良好的β-葡萄糖苷酶活性,其最适pH为5．0,最适温度为55℃。EDTA、Cu^2＋和Zn^2＋对该酶活性有较强的抑制作用。底物专一性分析表明,F—I能高特异性水解人工合成的底物pNPG,还能水解β-葡萄糖苷键连接的二糖如纤维二糖和龙胆二糖,说明此酶为一种β-葡萄糖苷酶。F—I对人参皂苷Rb1表现了较强的水解活性,而对人参皂苷Rb2和Rc的水解活性较低。该酶水解人参皂苷Rb1的路径为Rb1→Rd→F2→C—K。F—I对人参皂苷Rb1的这种高效水解为稀有人参皂苷的工业制备奠定了基础。     

Aβ_(25～35)和人参皂苷Rb1对鼠神经干细胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A表达的影响

目的:研究大鼠神经干细胞诱导分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达以及Aβ25～35和人参皂苷Rb1的调节作用。方法:取新生SD大鼠的海马组织体外培养获得NSCs,诱导第3代的NSCs向神经细胞分化1周后,免疫荧光细胞化学染色检测活化型GSK-3β(pTyr279,216)和蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)的表达及Aβ25～35和人参皂苷Rb1对它们的影响;RT-PCR分析糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、细胞周期依赖性蛋白激酶-5(CDK-5)和蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)的mRNA表达以及Aβ25～35和人参皂苷Rb1的影响。结果:免疫荧光细胞化学染色显示:NSCs诱导分化1周后有活化型GSK-3β(pTyr279,216)和PP2A的表达,Aβ25～35能增强GSK-3β(pTyr279,216)的表达同时抑制PP2A的表达,而人参皂苷Rb1则能逆转Aβ25～35的作用;RT-PCR检测发现:NSCs诱导分化1周后表达GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA,使用Aβ25～35处理后GSK-3β、CDK-5的表达增强而PP2A的表达减弱,用人参皂苷Rb1预处理神经干细胞后Aβ25～35的作用受到抑制。结论:体外培养的神经干细胞分化后表达GSK-3β、CDK-5和PP2A,并受Aβ25～35和人参皂苷Rb1的调节,提示在体外由神经干细胞分化的细胞具备正常神经细胞的蛋白磷酸化调节系统。     

一类中草药有效成分与BCL2相互作用的分子模拟研究

以一类中草药有效成分为研究对象,使用分子对接和分子动力学方法,研究了其与BCL2酶的相互作用。结果表明,筛选出的人参皂苷Re、人参皂苷Rb1具有最好的对接结果。通过分子动力学方法分别获取了人参皂苷Re、人参皂苷Rb1与BCL2结合的稳定结构。其中,人参皂苷Re与Asn143、Arg146、Phe104等9个氨基酸残基有疏水作用,形成了2个稳定性不同的氢键,其中O原子与残基Glu136形成的氢键较为稳定。人参皂苷Rb1分别与残基Phe112、Glu136、Arg146等9个氨基酸残基有疏水作用,形成7个氢键,其中与残基Asp140和Asp103中的O原子形成的2个氢键最为稳定。     

糖苷酶在人参皂苷转化中的应用

人参皂苷是人参中的主要活性成分。人参皂苷中含量较高的主要成分如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1和Re均是在人参皂苷的苷元原人参二醇(APPD)或苷元原人参三醇(APPT)上加上不同数量的葡萄糖基、阿拉伯糖基、木糖基或鼠李糖基等糖基形成的。这些主要人参皂苷脱去部分或全部的糖基的产物具有更强的生物活性及更好的人体吸收率。去除糖基的产物如Rg3、Rh2、化合物K(C-K)、F2、Rh1、Rg1、APPD、APPT在天然人参中不存在或含量极低,因此也被称为稀有人参皂苷。稀有人参皂苷可以通过糖苷酶水解主要人参皂苷获得。已报道的具备人参皂苷水解活力的糖苷酶有β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶及β-木糖苷酶。我们简要综述近5年来糖苷酶用于制备稀有人参皂苷的研究进展。     

西洋参总皂苷酶水解产物成分研究

西洋参总皂苷经β-糖苷酶催化水解,采用HPLC检测分析确定西洋参总皂苷中的主要原人参二醇型皂苷Rb1、Rd、Rc和Rb2已经完全被水解。水解产物通过反复硅胶柱层析和反向硅胶柱层析分离纯化得到7个皂苷,通过NMR谱图分析分别鉴定为人参皂苷compound K(1)、人参皂苷Mc(2)、人参皂苷Rg1(3)、人参皂苷Rg2(4)、人参皂苷Re(5)、人参皂苷F1(6)和拟人参皂苷F11(7)。β-糖苷酶催化西洋参总皂苷水解实验表明,西洋参中原人参二醇型皂苷的水解产物是人参皂苷compound K和人参皂苷Mc。     

人参茎叶总皂苷酶水解产物成分研究

人参茎叶提取物经β-糖苷酶催化水解后,经硅胶柱和RP-18柱反复层析纯化得8个化合物。通过波谱图分析及结合文献数据,分别鉴定为20(S)-达玛烷-3β,6α,12β,20,25-五醇(1)、人参皂苷compound K(2)、人参皂苷F1(3)、人参皂苷Rh13(4)、人参皂苷Rg2(5)、3β,20(S)-二羟基达玛烷-24-烯-12β,23β-环氧-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、人参皂苷Rg1(7)和人参皂苷Re(8)。其中化合物1为新的达玛烷皂苷元。化合物2为分离到仅有的原人参二醇型皂苷,表明该β-糖苷酶高效转化人参茎叶的原人参二醇型皂苷为人参皂苷compound K。     

人参皂苷Rb3糖基水解酶的纯化及其反应特性

人参皂苷Rb3是三七茎叶皂苷的主要成分。为了充分利用廉价的三七茎叶皂苷,该研究以微生物Aspergillus sp. P90r菌为对象,综合运用生物转化的方法,经过提取、分离纯化和酶活力测定等步骤,最终以确定酶反应途径的方式得到了所产的特异性人参皂苷Rb3糖基水解酶的相关性质和动力学等反应特性。结果表明:该酶比Absidia sp. GRB3-X8r菌产酶活力高15%~25%,SDS-PAGE电泳结果测得分子量约为65.6ku,纯化后酶蛋白的含量为0.237 mg·mL~(-1),蛋白比活力可达到169 U·mg~(-1),纯化倍数为13.70,回收率为9.39%。人参皂苷Rb3糖基水解酶在pH=5.0的偏酸性环境下酶活力很高,最适反应条件:pH=3.0~5.0,温度45℃,其中在pH=4.0~6.0范围内相对稳定。该酶在20 min时进入混合级反应,酶反应米氏常数Km值为8.77 mmol·L~(-1),V_(max)为57.44 mmol·L~(-1)·h~(-1),在60 min时反应速度达到最大,Vmax趋于稳定,为66.63mmol·L~(-1)·h~(-1)。通过对酶的催化特性研究表明,该酶先水解Rb3的20-O-木糖基,其次水解3-O-葡萄糖基,最终催化反应产物中有F2和C-K生成。综上结果,微生物Aspergillus sp. P90r菌酶具有能水解人参皂苷Rb3木糖基和葡萄糖基的特异性。     

三七总皂苷酶水解产物成分研究

为了研究葡萄糖苷酶催化三七提取物的水解产物中主要皂苷成分。采用色谱法从三七提取物水解产物中分离纯化得到11个皂苷成分。利用波谱解析确定了它们的结构,分别鉴定为20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1),以及10个已知的皂苷成分分别为:人参皂苷compound K(2)、3β,12β,20(S),25-四羟基达玛-23-烯-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、3β,20(S)-二羟基达玛-24-烯-12β,23β-环氧-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、3β,12β,20(S)-三羟基-25-过氧羟基达玛-23-烯-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、人参皂苷F1(6)、人参皂苷Rg1(7)、人参皂苷Rg2(8)、人参皂苷Mc(9)、20(S)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)和人参皂苷Re(11)。其中化合物1为新化合物,化合物3~5和10为首次从三七中被分离得到。     

人参皂苷Rb1对Aβ_(1-42)导致的Tau蛋白异常磷酸化的影响

为探讨人参皂苷Rb1对Aβ_(1-42)所致小鼠脑片微管相关蛋白(Tau)异常磷酸化的抑制作用及其可能机制,采用Aβ_(1-42)诱导小鼠海马脑片建立Tau蛋白过度磷酸化模型,运用免疫印迹方法观察人参皂苷Rb1对Aβ1-42导致小鼠脑片p-Tau、p-Erk1/2、Erk1/2蛋白水平的影响。实验结果显示,模型组p-Tau、p-Erk1/2表达水平明显高于空白对照组(P0.01);与模型组比较,人参皂苷Rb1各剂量组p-Tau、p-Erk1/2表达水平显著性降低(P0.01或P0.05),且大、中剂量组优于小剂量组;人参皂苷Rb1呈一定的剂量依赖性下调Aβ_(1-42)导致的p-Tau、p-Erk1/2的蛋白水平。本研究表明,人参皂苷Rb1可能通过抑制Erk1/2的激活逆转Aβ_(1-42)所导致的Tau蛋白水平的升高来减少神经纤维缠结。     

蜗牛酶中一种人参皂苷Rb1水解酶的分离纯化

通过DEAE-Sepharose离子交换分段层析,DEAE-Sepharose离子交换梯度层析和SephadexG-100凝胶过滤层析三种方法的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出一种人参皂苷Rb1水解酶。分离后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质务带。应用SDS-PAGE和凝胶过滤层析对分子量的测定,提示该酶是由4个分子量为110～115kD的相同亚基组成的同源四聚体。Rb1为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0．790mmol／L和10．192μmol／min／mg。该酶对人参皂苷Rb1糖键进行有选择的水解,可水解人参皂苷Rb1C50位的一个糖苷键生成人参皂苷Rd。     

人参生殖器官皂苷含量动态变化

为了明确从现蕾、开花到结实过程中的人参生殖器官中各单体皂苷含量的动态变化,应用HPLC法测定了人工栽培的五年生人参不同时期生殖器官中的人参单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1和Rg3的含量。结果显示:从现蕾到果实成熟的过程中,人参单体皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1和Rg3的含量的平均值分别为0.643%,0.189%,1.026%,1.014%,1.941%,8.381%,0.724%和0.041mg.g-1。从现蕾到果实成熟的过程中,人参单体皂苷Rb1含量的最高值在7月16日,单体皂苷Rb3、Rc、Rd和Rg1含量的最高值在7月11日,单体皂苷Rb2和Rg2含量的最高值在8月7日。     

人参药材中人参皂苷与生态因子的相关性及人参生态区划

为了扩大人参(Panax ginseng)栽培面积, 解决人参资源日益短缺的问题, 研究了人参皂苷与生态因子之间的相关性。利用超高效液相(UPLC)色谱法, 测定了辽宁、吉林和黑龙江三省不同产区人参样品中3种人参皂苷(Rg1、Re和Rb1)的含量, 并基于“中药材产地适宜性分析地理信息系统”(TCMGIS)平台, 获得采样区域10个生态因子(包括活动积温、年平均气温、海拔、相对湿度、年日照时数、年降水量、7月最高气温、7月平均气温、1月最低气温和1月平均气温等)数据; 利用因子分析法对16个人参基地进行因子得分评价, 得分最高的是吉林和辽宁的人参基地, 故将吉林和辽宁的人参基地作为人参生态适宜性分析的最佳区域; 通过偏最小二乘回归法建立3种人参皂苷成分与上述10个生态因子间的回归方程并获取其相应的权重, 结果发现多个温度因子与人参皂苷含量呈强负相关关系, 说明热量因子对人参皂苷活性成分的累积起主要作用, 而水分因子、地理因子和光照因子与人参皂苷含量呈弱相关关系; 以因子得分最高的吉林和辽宁人参基地为基点区域, 分别对3种人参皂苷进行单成分生态适宜性区划以及综合区划, 得知3种人参皂苷成分积累的最佳区域主要集中在长白山脉, 而燕山山脉和太行山脉只有少量分布区域。     

从西洋参中提取分离纯化人参皂苷R_(b1)和人参皂苷R_e的研究

用大孔吸附树脂从西洋参提取物中富集西洋参总皂苷,再利用丙酮沉淀及重结晶方法获得高纯度的人参皂苷Rb1和Re.可以得到含量大于95%的人参皂苷Rb1(收率2.6%)和92%的人参皂苷Re(收率0.5%),以及纯度为98.5%的人参皂苷Rb1(收率2.0%)和97.8%的人参皂苷Re(收率0.25%).该方法简便、实用,适用于工业大生产,为进一步开发成新药奠定了基础.     

响应面法优化微波提取绞股蓝愈伤组织中人参皂苷Rb1的工艺研究

以绞股蓝愈伤组织为原料,优化绞股蓝人参皂苷Rb1的微波提取工艺,在单因素试验的基础上,选择液料比、微波功率和微波处理时间为自变量,人参皂苷Rb1为响应值,采用响应曲面法设计、分析研究各自变量及其交互作用对人参皂苷Rb1提取率的影响.利用响应面分析方法,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,并确定人参皂苷Rb1微波辅助提取工艺的最佳条件为：料液比1：20（g/mL）,处理时间6 min,微波功率200 W.在此最佳工艺条件下,人参皂苷Rb1得率为3.95 mg/g.     

人参皂苷Rb1对油酸诱导HepG2细胞脂肪堆积的影响作用

通过建立体外肝细胞脂肪堆积模型评价人参皂苷Rb1清除肝细胞脂肪堆积的能力.方法:1 mmol· L-1油酸诱导建立HepG2细胞脂肪堆积模型,从噻唑兰染色吸光度(MTT值)、甘油三酯(TG值)、细胞内脂滴形态3方面评价人参皂苷Rb1的作用.结果:人参皂苷Rb1可明显减轻细胞内脂质堆积现象,显著降低细胞中TG含量,其中100 μg·mL-1人参皂苷Rb1对TG的清除率达37.9％.结论:人参皂苷Rb1具有良好的体外降脂活性,对脂肪肝有较好的预防效果.     

人参皂苷与生态因子的相关性

环境条件影响中药材活性成分的形成和积累.利用各种数学统计分析方法探讨影响人参皂苷积累的生态因子,提高人参品质.人参样品采自人参道地产区(主产区)吉林、辽宁、黑龙江三省5年生栽培人参,同时采集采样点处的土壤样品.超高效液相(UPLC)色谱法分析了不同产区9种人参皂苷(Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd)的含量;利用“中药材产地适宜性分析地理信息系统”的生态因子空间数据库,获得采样区包括温度、水分、光照等10个生态因子数据;按土壤理化性质常规方法测定土壤样品中的有效硼、有效铁等微量元素和速效氮、速效钾等有效养分.对人参有效成分含量与土壤养分进行典型相关性分析发现,土壤中的有效硼、有效铁、速效氮与人参皂苷含量呈显著正相关,即适当提高土壤中有效硼、有效铁和速效氮的含量可以促进人参皂苷成分的积累,土壤水分与所测人参皂苷含量(Rb3除外)呈显著正相关,速效磷(P)、pH、速效锌(Zn)与各人参皂苷含量呈弱相关;人参皂苷与气候因子相关分析表明,温度(年活动积温、年平均气温、7月最高气温、7月平均气温、1月最低气温、1月平均气温)与人参皂苷含量呈显著负相关,其中与药典中人参含量测定项下的人参皂苷Rg1、Re、Rb1负相关尤为显著(r＞0.6),说明在一定温度范围内,人参皂苷是随着温度的降低而升高的,即适当低温有利于人参皂苷有效成分的积累;海拔与人参皂苷Rc、Rb2、Rb3含量呈显著正相关(r＞0.6),即相对较高的海拔可以促进这3种成分的积累;而年均降水量、年相对湿度和年均日照时数与人参皂苷相关不显著.通过主成分分析(PCA)、典型相关分析、排序等统计方法,考察不同产地样品中人参皂苷含量与生态因子间的相关性,研究结果揭示了温度在人参的主要活性成分-皂苷类形成中起决定性作用,在一定的温度范围内,温度越低越有利于人参皂苷的积累;阐明了土壤中的有效硼、有效铁、速效氮与人参皂苷含量成正相关.研究结果提示在人参实践生产中可以通过适当低温处理,增施硼、铁、氮肥等农艺措施来调控人参皂苷含量.     

人参皂苷Rb3对胰脂肪酶的抑制作用

采用硅胶柱层析、JTY树脂分离制备人参皂苷Rb3,薄层板(TLC)跟踪,高效液相色谱法(HPLC)检测。目的是研究西洋参叶中不同浓度的人参皂苷Rb3对胰脂肪酶的抑制作用影响,从而表明人参皂苷Rb3在抗肥胖中的作用。用制得的人参皂苷Rb3,在卵磷脂所乳化的甘油三酯的检测系统中进行体外胰脂肪酶抑制实验。结果表明:制得的人参皂苷Rb3经过三种不同展开剂,薄层板展开,均为一个点,进一步经HPLC检测其纯度为93.2%。胰脂肪酶抑制试验结果表明人参皂苷Rb3在浓度为0～1 mg/mL时,其抑制率达到85.11±0.409%,而且远远高于西洋参叶提取物。本文通过胰脂肪酶抑制试验表明Rb3具有抗肥胖作用,其抑制机制有待进一步研究。     

外源人参皂苷对人参种子萌发和幼根抗氧化酶活性的影响

研究不同浓度外源人参皂苷(人参总皂苷,人参二醇组皂苷,人参三醇组皂苷, Rb族,Rb3,Re共4种皂苷混合物和两种单体皂苷)对人参种子萌发,幼苗根长、鲜重,幼根中抗氧化酶活性和MDA含量的影响.结果表明:所测试人参皂苷对人参种子萌发、人参幼苗根长生长和幼根鲜重增加均具有抑制化感效应,且抑制程度均随处理浓度的升高而增强;对人参幼根中抗氧化酶活性方面,不同浓度人参总皂苷,人参二醇组皂苷,人参三醇组皂苷处理后,人参根系中SOD,POD和CAT活性均有明显提高,呈现出各酶活性随浓度升高而逐渐增强的效应;人参皂苷Rb族处理后,SOD活性在低中浓度处理时,与对照差别不大,中高浓度处理后低于对照,POD活性在中高浓度处理后显著提高,高浓度处理后活性降幅较大难以恢复到对照水平,CAT活性均低于对照;人参皂苷Rb3处理后,SOD活性均低于对照水平,POD活性在低浓度处理时与对照相当,中高浓度处理后显著低于对照水平,CAT活性逐渐降低,在低中浓度处理时略高于对照,高浓度处理后低于对照水平;人参皂苷Re处理后,SOD和POD活性均显著低于对照.人参幼根中MDA含量均随着处理浓度的增加而升高.     

西洋参冠瘿组织悬浮培养及其人参皂苷类成分的分离

对西洋参冠瘿组织悬浮培养生长特征进行了考察,并对其悬浮培养物中的人参皂苷类成分进行了提取、分离和鉴定。研究得到了培养物最大生物量收获时间［18.62 g/L(dry weight)］及其中最高人参皂苷累积时间（620.4 mg/L on the 27thday）。培养基中碳源、磷、氨基氮、硝基氮的利用率分别为91.8%, 100%, 81% 和97%。利用现代分离纯化方法从培养物中分离得到了4种人参皂苷类成分,利用理化及谱学技术分别鉴定为假人参皂苷F11（pseudoginsenoside F₁₁,Ⅰ）, 人参皂苷Rd（ginsenoside Rd,Ⅱ）, 人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1 ,Ⅲ）和人参皂苷Rb3（ginsenoside Rb3,Ⅳ）。