农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦(Triticum aestivum L.)的获得及分析

以本实验室选育的小麦优良品系的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞,经筛选获得抗卡那霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR和实时PCR检测、PCR-Southern和Southern blot验证,确定了3株独立再生植株为含有CpTI的转基因植株。农杆菌菌浓度、侵染时间及转化处理方式对小麦转化率均有明显影响。3株转基因植株正常可育并结籽,形成转基因株系。外源基因在转基因植株T₁代中的分离呈多样性,部分株系（转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ）表现出孟德尔遗传规律。抗虫试验表明,3株转基因植株T₂代籽粒对储粮害虫麦蛾具有一定的抗性,转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ及非转基因植株的T2代籽粒虫蛀率分别为19.8%、21.9%、32.9%和58.3%。转基因植株T₁代群体农艺性状调查显示,3个株系具有良好的农艺性状,为小麦的遗传改良提供了新的种质抗虫材料。     

通过构建三段T-DNA载体高频率获得无标记转基因大豆植株的研究

高频率获得无选择标记转基因植株有利于转基因植物的环境释放和安全性生产,农杆菌介导的共转化法是获得无标记转基因植株的方法之一。含二段T-DNA载体的共转化法已被人们成功应用,而二段以上T-DNA载体的共转化法还未见报道。基于这一目的,通过几个中间质粒构建了含有三段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1,其中包含1个拷贝bar基因选择标记基因表达盒和2个拷贝VIP1目的基因表达盒。利用EHA101农杆菌菌系介导法转化大豆子叶节,经过在含3～5mg/L glufosinate培养基上多次筛选,获得了一定数量抗性再生植株,然后对抗性再生植株进行叶片涂抹除草剂、Southern blot和Northern blot检测,共鉴定出51棵T₀代转基因植株,转化频率0.83%～3.16%,二个基因的共转化频率为86.4%。在对T₁代群体进行叶片涂抹除草剂检测的基础上,不抗除草剂植株进行PCR、Southern blot和Northern blot检测,共鉴定出41棵无选择标记转基因植株,无标记植株获得率为7.6%。检测结果还表明,T₁代群体中22.7%的株系发生了基因丢失现象,27.3%的株系发生了bar基因沉默现象,目的基因在37.1%的无标记植株中发生了沉默现象。三段T-DNA的双元表达载体是获得无标记转基因植株的理想途径     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T₀代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T₁代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

施钾量对设施基质栽培番茄生长生理及其产量和品质的影响

以番茄品种‘184’为材料,采用水肥一体化番茄设施基质栽培模式,以甘肃农业大学植物营养液配方C中钾肥为对照(T₁常规钾肥量),再在配方C中添加不同量钾肥组成T₂(钾肥增量25%)、T₃(钾肥增量50%)、T₄(钾肥增量75%)等处理,探究不同施钾量对设施基质栽培番茄生长、生理、产量及品质的影响,并筛选设施基质栽培条件下最佳施钾量。结果显示：(1)与常规施钾肥量(T₁)相比,增施钾肥处理(T₂-T₄)均可显著提高番茄株高、茎粗、根系活力,且T₃处理的各指标均最高,但增施钾肥对叶片数的影响不显著。(2)增施钾肥处理较T₁均能够显著提高番茄叶片光合色素含量,增强光合和荧光过程,进一步促进光能的吸收与转化,且T₃处理的增幅最高。(3)随着施钾量的升高,增施钾肥处理的番茄单果重、果实产量呈现不同程度的增长趋势,适量增施钾肥处理增幅均达到显著水平,并以T₃番茄产量最高,且较T₁显著增产20.87%。(4)与T₁相比,各施钾处理番茄果实硬度、可溶性总糖、Vc、可溶性蛋白、番茄红素含量等均有不同程度提升,各指标均随着施钾量增加呈先上升后下降的变化趋势,并在T₃处理下达到最优。(5)主成分分析表明,各处理的综合得分依次为T₃＞T₄＞T₂＞T₁。研究发现,在设施基质栽培条件下,适量增施钾肥能显著提高番茄植株光合作用效率,促进植株生长,达到提高果实产量和改善品质的目的,并以常规钾肥增量50%处理的效果最佳。     

枸杞LbMYB103基因克隆及转化拟南芥的研究

以枸杞品种‘宁杞1号’花药为材料,采用 RT-PCR技术,分离了R2R3类MYB基因LbMYB103包含完整开放阅读框（ORF）的cDNA片段,碱基序列与已知基因HQ415755完全一致。运用Gateway技术构建LbMYB103基因植物过表达载体pMDC83-LbMYB103,利用基因枪法将融合有绿色荧光蛋白（GFP）的过表达载体转入洋葱表皮细胞,将LbMYB103基因定位在细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,LbMYB103基因在花药中优势表达,果实中表达量较低,在根、茎和叶中均未检测到其转录本,推测LbMYB103基因可能在花药发育过程中起重要作用。通过根癌农杆菌介导法将pMDC83-LbMYB103转入拟南芥（Col-0）,经筛选获得T₁代抗性再生植株52棵,PCR鉴定有41棵阳性植株,收获T₁代种子,经抗性筛选获得T₂代抗性植株29棵,PCR鉴定有23棵阳性植株。实时荧光定量PCR分析表明,LbMYB103在拟南芥植株的基因组中正常表达。表型观察发现T₁和T₂代拟南芥花药发育异常,花发育迟缓,果荚短小无种子,进一步表明LbMYB103可能与植物的育性有关。该结果为进一步开展枸杞遗传转化,深入研究LbMYB103基因在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能奠定了基础。     

转反义trxs基因小麦株系00T89分子鉴定及抗穗发芽特性研究

以皖麦48为受体导入反义trxs基因已获得00T89第4代（T₄）转基因株系,对其进行反义基因的PCR鉴定、相对定量RT-PCR基因表达检测以及抗穗发芽特性研究。结果表明,18个T₄代转基因株系中,13个株系目的基因检测呈阳性;成熟期籽粒萌发过程中,8个株系转录水平上mRNA丰度极显著降低（P<0.01）,mRNA丰度与穗发芽指标呈显著和极显著的相关性（r=0.7181）。其中6个株系在开花后30d至成熟后10d表现出明显的抗穗发芽特性。与非转基因对照相比,平均穗开始发芽时间推迟2.7d（P<0.01）,穗粒发芽率和穗发芽度分别降低35.5%（P<0.01）和47.5%（P<0.01）,成熟后25d这些株系又逐渐恢复发芽特性,无显著差异（P>0.05）。     

大麦TILLING群体的构建及EDR1基因突变的检测

该研究选用栽培大麦品种‘西引2号’,通过化学诱变剂甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）处理,创建了3 750个 M₁及2 012个 M₂突变株系。结果表明：在M₂中,有115株表现黄化,98株表现矮化,101株表现极早或极晚抽穗,其他35株表现分蘖少、叶片小或者不育等性状,所有突变株系占M₂群体的17.35%;M₂的基因组DNA用于突变频率的研究,用优化的CELⅠ酶切体系对M₂株系进行了EDR1基因突变体筛选,获得了EDR1基因的3个突变体,其中一个发生在外显子区域,导致了氨基酸Pro到Ser的转换,突变频率平均为每661 kb一个点突变,这与前人研究的突变频率基本在一个范围内。该研究创建了大麦品种‘西引2号’的TILLING筛选群体,并用于EDR1突变体的筛选。为大麦性状研究提供了不同的思路,搭建了新的资源和技术平台。     

电击法介导的紫孢侧耳原生质体转化

使用基因脉冲导入仪成功地将糙皮侧耳DNA导入紫孢侧耳单核原生质体内,获得了具有"锁状联合”特征的双核转化菌株T₁,和T₂。转化率为8．2×10^-5,转化比为3．6％。酯酶同I酶分析结果表明,转化菌株除具有受体菌的酶带外,还存在供体菌的酶带,由此证明转化菌株确为紫孢侧耳和糙皮侧耳DNA重组的产物。转化菌株子实体形态也发生了变化。两菌株子实体均不释放孢子;T₁。菌柄中生,T₂成熟子实体菌盖中部易长出菌丝。     

转基因油菜中核酶介导的对花椰菜花叶病毒的高度抗病性

设计了特异切割花椰菜花叶病毒(CaMV,ds DNA病毒)35S RNA的锤头型核酶基因(Rz);同时将核酶保守区内的一个G碱基以U代替构成核酶突变体(mRz)作为对照.体外切割实验表明.Rz可按设计要求高效特异地切割355 RNA,而mRz则完全没有切割活性.将Rz和mRz克隆到pROK2构建成植物表达载体pROK2-Rz和pROK2-mRz.采用转化下胚轴法转化油菜,通过筛选获得转Rz和mRz基因油菜植株、攻毒实验证明Rz当代转化植株表现出对CaMV的高度抗病性,75%的植株不表现任何症状,也测不出CaMV的存在,其抗病植株的T₁后代的抗病性按孟德尔定律3:1分离.mRz当代转化植株及其T₁后代植株只具有极其微弱的减轻症状的作用.     

促甲状腺激素单克隆抗体的制备

获得了抗促甲状腺激素(TSH)单克隆抗体杂交瘤细胞20株,其中T₇₄A₁₀小鼠腹水滴度为1:50 000,亲和常数为7.15×10⁹L/mol,T₇₁B₁₁小鼠腹水滴度为1:150000,亲和常数为8.75×10⁹L/mol.两个抗体与人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)的交叉反应分别小于1.1×10^-6%、0.01%和0.016%.将T₇₄A₁₀和T₇₁B₁₁应用于TSH免疫放射分析中,得到了满意的结果.     

水稻T-DNA插入突变体库的筛选及遗传分析

T-DNA标签技术是分离和研究植物功能基因的有效方法,寻找T-DNA插入表型突变体是进一步开展研究的关键所在。文章对以ZH11、ZH15为受体亲本构建的4416份T,代标签系进行了表型鉴定,发现存在拟纯合突变和系内分离突变两种类型,突变表型涉及株高、生育期、叶形、叶色、分蘖力、植株松紧度、穗颈节、穗形、颖花、粒形、类病变、雄性不育、生长极性等14类性状。其中,株高、生育期、叶色、雄性不育有着相对较高的突变频率（超过1％）,株高和叶色的突变频率在品种及年度间表现稳定,而生育期、雄性不育波动较大,表明这类性状的表型易受到环境的影响。通过T1、T2连续世代的共分离分析,筛选出3个与穗部或颖花发育相关的T-DNA插入突变体,为分离相关功能基因奠定基础。随机选择42份有表型突变的标签系,通过质粒拯救和TAIL-PCR的方法分离其侧翼序列,从39个标签系中获得40条序列,其中25条为载体序列,14条与水稻基因组有很好的同源性,BlastN分析结果表明T-DNA有优先整合进植物功能基因内部的特性。     

水稻雄性不育系及雄性不育突变体筛选研究进展

 为了获得新细胞质源的水稻雄性不育系及雄性不育突变体,以解决目前杂交水稻生产上所面临的不育系来源单一的问题,人们采用了常规育种、诱变育种、组织培养和离体诱变等方法,其中离体筛选尤显其优势性,但也有不少问题有待解决,如能通过离体培养定向地筛选出雄性不育系及雄性不育突变体,无疑将大大提高工作效率。此外,对影响离体筛选雄性不育突变体的因素进行了探讨。     

Developing disease‐resistant thermosensitive male sterile rice by multiplex gene editing

High-quality and disease-resistant male sterile lines have great potential for applications in hybrid rice breeding. We introduced specific mutations into the TMS5, Pi21, and Xa13 genes in Pinzhan intermediate breeding material using the CRISPR/Cas9 multiplex genome editing system. We found that the transgenefree homozygous triple tms5/pi21/xa13 mutants obtained in the T1 generation displayed characteristics of thermosensitive genic male sterility(TGMS) with enhancedresistance to rice blast and bacterial blight. Our study provides a convenient and effective way of converting breeding intermediate material into TGMS lines through multiplex gene editing, which could significantly accelerate the breeding of sterile lines.     

水稻转化体系的改进及转os-miR398基因植株的获得

针对根癌农杆菌介导的愈伤转化技术在实际应用中转化效率低及农杆菌污染等问题,对该方法在水稻转化过程进行改良:(1)在转化前将空白愈伤从培养基取出,于室温放置在空白皿中约24 h,使之处于饥饿状态,以利于T-DNA转化并提高转化率;(2)在愈伤与农杆菌共培养并经无菌洗脱后,在转移到相应培养基之前,将其于室温下继续放置在含有滤纸的培养皿里约24 h,从而有效地抑制农杆菌生长.采用本改良措施,成功将所克隆构建的os-miR398(水稻microRNA398)前体基因表达载体转化入水稻,与对照相比,改良后水稻转化效率可提高10%.     

籼稻二元不育系9730A及三交种的初步研究

通过对所选育的籼稻二元不育系9730A的花粉育性、自交结实率、雌性育性、对"920"的敏感性、柱头外露情况、花时、雄性不育的可恢复性及三交种的抽穗整齐度、有效穗、株高、单株产量、结实率、主茎穗长、主茎叶长、穗粒等变异度的分析,对杂交水稻三交法育种的应用价值进行初步探讨.结果认为:通过引进具有不同优良品种特性的第二保持系,可以在保持所选育杂种品种主要农艺性状整齐一致的前提下,较大幅度地拓宽品种的遗传基础,改进雄性不育系的异交性能,从而为提高杂种种子生产水平、及时利用优良常规稻育种成果材料和综合实现杂交稻品种选育过程中的多抗、广适、高产、优质育种目标提供新的途径.     

辐射诱变创制水稻新种质研究进展及浙粳99突变体库的建立

辐射诱变育种所需年限短、变异率高、后代性状稳定快,在作物遗传育种中已广泛应用。本文统计了我国近10年来利用辐射诱变技术培育的在生产应用上发挥重要作用的部分优良新品种18个,说明通过辐射诱变可加速水稻变异,丰富水稻遗传图谱,为培育高产、优质、抗病水稻新品种提供更多类型种质资源。此外总结了利用辐射诱变获得的各种类型突变,包括茎秆突变体如高秆、矮秆、粗秆、茎扭曲等;叶部性状突变体如叶色、叶长、条纹、叶斑等;穗部性状突变体如穗型、穗色、籽粒大小、籽粒形状等;生理性状相关突变体如早衰、不育、晚熟、不抽穗等。系统介绍了产量相关突变体、茎秆相关突变体、叶形相关突变体、穗部相关突变体、抗性相关突变体和稻米品质突变体等各类水稻突变体及其基因定位、作用机理研究进展,并通过辐射技术诱变浙粳99水稻种子,初步研究了获得的多种类型突变体,进行了相关表型分析,为水稻功能基因克隆奠定了基础,同时为水稻育种提供了优异种质资源。     

抗南方水稻黑条矮缩病水稻光温敏核不育系的筛选和鉴定

对东乡野生稻(Oryza rufipogon Griff.)3个生态群落株系及协青早B//协青早B/东乡野生稻的BC1F6株系进行了南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定,筛选出抗性较好的种质资源。利用筛选到的协青早B//协青早B/东乡野生稻抗性株系,与光温敏核不育系C47S杂交转育,鉴定筛选到6份抗性较好的光温敏核不育系,为选育抗南方水稻黑条矮缩病的两系杂交稻组合奠定了材料基础;同时研究发现,来源于东乡野生稻的对南方水稻黑条矮缩病的抗性可能由数量性状基因控制。     

利用转hpRNA基因水稻抗水稻矮缩病毒

具有发夹结构的双链RNA(hairpin RNA,hpRNA)能高效诱导转录后基因沉默的发生.以水稻(Oryza sativaL.)矮缩病毒(RDV)基因组中第八片段编码区128～754 bp的序列为臂构建hpRNA,并克隆到植物表达载体pROK-2上.通过农杆菌介导的方法转化水稻"中花11".Southern blot分析表明,共获得12株阳性转化体.用带有RDV的叶蝉(Nephotettix cincticeps)接种Tl代转hpRNA水稻,结果表明转基因水稻对RDV具有高抗性或表现为症状延迟.而相同序列的有义链的转基因水稻和空载体的转基因水稻表现为典型的RDV侵染症状.HpRNA在转基因水稻中对RDV高抗性发挥重要作用.     

Screening for and Genetic Analysis on T-DNA-inserted Mutant Pool in Rice

T-DNA tagging technique has provided a powerful strategy for identifying new functional genes in plants, and the key for success is the discovery of T-DNA-inserted mutants with changed phenotype. In this study, we screened 4 416 rice T₁ tagged lines generated by enhancer trap system integrated with GLL4/VP16-UAS elements from two transformed parents, ZH11 and ZH15. We found many lines showed obvious morphological mutations, including two types—fake-homozygous mutation and separating mutation. The mutation phenotype was related to 14 kinds of trait such as plant height, heading date, leaf shape, leaf color, tiller number, panicle shape, spikelet number, grain shape, disease-like mutation, male sterility, awn, and so on. Among them, plant height, heading date, leaf color and male sterility had a comparatively high mutation frequency (over 1%). The mutation frequency of plant height and leaf color had no significant change between different years or transformed parents, but the frequency of heading date and male sterility varied greatly, suggesting that environment had a great effect on the expression of latter two traits. By conducting continuously co-segregating analyses in T₁ and T₂ generation, we identified 3 T-DNA-inserted mutants with malformed panicle or spikelets, which would provide a base for cloning correlative functional genes. At the same time, we selected randomly 42 lines with mutation phenotype and obtained 40 flanking sequences from 39 tagged lines by plasmid rescue or TAIL-PCR, of which, 26 were vector backbone sequence, 14 had good identity to rice genome sequence. The BlastN result showed the T-DNA preferentially integrated into protein-coding region in plants.