脂肪间充质干细胞体外分化成心肌样细胞

探讨大鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSC）体外分化成心肌样细胞的潜能,为自体干细胞移植治疗心肌梗死提供理论基础.采用消化法分离大鼠AMSC,培养于RPMI1640生长培养基中,倒置相差显微镜观察细胞形态发现,随着培养时间的延长,细胞形态趋向于心肌细胞,SQ RT-PCR检测表达心肌特异性基因：β-肌球蛋白重链（β-MHC）、α-肌球蛋白重链（α-MHC）、心房利钠肽（ANP）、心肌肌钙蛋白（cTnT）、心肌肌动蛋白、肌肉增强因子和GATA-4;免疫细胞化学和免疫荧光染色检测表达心肌细胞特异性蛋白：结蛋白、横纹肌辅肌动蛋白、心肌肌动蛋白和间隙连接蛋白45(connexin 45);Western印迹检测表达心肌特异性蛋白Nkx2.5. 实验表明,大鼠AMSC在体外培养条件下能分化成心肌样细胞,在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景.     

hhlim促进DMSO诱导的P19细胞向心肌分化

为了确定hhlim是否参与胚胎期的心肌分化和发育过程,用可表达hhlim蛋白和hhlim反义RNA的真核表达质粒转染P19胚胎干细胞,经G418筛选得到稳定表达hhlim和hhlim反义RNA的P19细胞克隆后,观察hhlim对P19细胞向心肌分化和发育的影响.结果显示,Nkx2.5和GATA-4在未被外源性hhlim基因转染的P19细胞中不表达.DMSO刺激细胞2天后,GATA-4开始表达,3天后Nkx2.5的表达活性显著升高.hhlim的过表达不但有利于P19细胞的存活和生长,而且还可以使Nkx2.5和GATA-4的表达比对照细胞提前1天.反义hhlim细胞株被DMSO诱导5天后,细胞仍呈集落化生长.同时,Nkx2.5和GATA-4开始表达的时间明显延滞.结果表明,hhlim能促进P19细胞向心肌细胞分化,其作用是通过促进转录因子GATA-4和Nkx2.5的表达而实现的.     

二甲基亚砜对P19细胞体外分化为心肌细胞的影响

体外应用不同浓度二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)诱导P19细胞向心肌细胞分化,通过免疫细胞化学、流式细胞、RT-PCR方法检测α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)及GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)mRNA表达。结果显示,DMSO处理结合悬浮培养可诱导部分P19细胞分化为节律跳动的心肌细胞,分化的细胞α-SA、cTnT表达阳性,同时表达心肌特异GATA-4、α-MHCmRNA。1.0%DMSO组α-SA、cTnT阳性细胞免疫荧光强度及GATA-4、α-MHCmRNA表达水平明显高于0.5%及0.8%DMSO组。表明DMSO的诱导作用与其浓度有关。     

Lrrc10在体外心肌发生过程中的表达研究

Lrrc10是一心脏特异新基因.为探讨Lrrc10在心肌细胞分化过程中的表达,采用DMSO诱导P19细胞分化,建立体外心肌发生模型,显微镜观察细胞形态变化,以心α-MHC和β-MHC作为心肌分化的标志,RT-PCR检测分化过程中各基因的表达.结果 表明,P19细胞经诱导后形态发生明显变化;α-MHC在诱导分化6 d时开始表达,β-MHC在诱导分化8 d时开始表达,表明心肌分化成功.而Lrrc10在诱导分化2 d时就开始表达,提示其功能可能与心肌分化有关.     

骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化后超微结构和细胞因子表达的变化,为下一步细胞移植治疗扩张型心肌病提供理论依据。方法在体外扩增、定向诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的基础上,电镜下观察骨髓基质干细胞诱导前后超微结构的改变,RT-PCR检测心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表达,并与原代培养的心肌细胞比较,观察二者之间的生物学异同。结果免疫组化法证实诱导后的骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化,电镜下胞浆内可见糖原颗粒,肌原纤维排列与原代培养的心肌细胞相似;RT-PCR证实诱导后的骨髓基质干细胞表达心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。结论骨髓基质干细胞经5-氮胞苷定向诱导后在超微结构和细胞因子的表达上类似于心肌细胞,已向心肌样细胞分化。     

MSCs心肌样细胞分化过程中GCN5募集促分化相关蛋白的筛选

筛选并分析间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导分化为心肌样细胞过程中GCN5招募促分化相关蛋白集合体的组成。免疫荧光细胞化学、实时荧光定量PCR鉴定MSCs经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)诱导分化为心肌样细胞;免疫共沉淀技术分离、串联质谱鉴定GCN5募集蛋白集合体组成,并从心肌细胞分化角度筛选、验证分化相关蛋白因子。MSCs经5-azaC诱导分化的心肌样细胞表达心肌特异性基因GATA4、MEF2C和心肌细胞结构、功能蛋白cTnt、MHC和Cx43;筛选、验证出心肌细胞分化相关GCN5招募蛋白归类为:(1)DNA结合蛋白Sp1/KLF;(2)转录辅激活子PGC-1α和Rb1;(3)转录延伸复合体组成成分以及信号通路蛋白Akt。通过筛选获得MSCs经诱导向心肌样细胞分化过程中心肌分化相关蛋白因子,为进一步研究干细胞分化信号传导途径、特异性生物靶点干预以及提高干细胞分化效率打下了基础。     

miR-148a在5-aza诱导间充质干细胞心肌样分化中的调控作用及机制

目的：探讨miR-148a在5-aza诱导人骨髓间充质（hMSCs）成心肌样分化中的表达及miR-148a对hMSCs体外成心肌样分化的生物学作用。方法：免疫荧光检测5-aza诱导hMSCs分化后心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平;qRT-PCR和Western blot分别检测miR-148a和DNMT1在hMSCs成肌样分化中的表达水平。利用Lipofectamine TM 2000将miR-148a mimics和miR-148a inhibitor分别瞬时转染hMSCs,Western blot检测心肌细胞特异性标志物α-MHC的蛋白表达水平。利用生物信息学技术预测miR-148a的靶基因结合位点利用双荧光素酶报告基因系统鉴定其对靶基因3'UTR的结合序列。通过DNMT1 shRNA和miR-148a inhibitors共转到hMSCs中,研究miR-148a在hMSCs成心肌样分化中的调控作用。结果：hMSCs经5-aza诱导分化后,心肌细胞特性标志物α-MHC蛋白水平明显上调。miR-148a在hBMSCs成肌样分化中显著性增加（P<0.01）,DNMT1表达水平显著降低。过表达miR-148a能提高hBMSC中心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平,而抑制miR-148a则能降低其水平（P<0.01）。DNMT1沉默可以阻断miR-148a对hMSCs的诱导成肌样分化作用。结论：miR-148a在hMCCs成肌样分化中表达上调,通过靶定和调控DNMT1基因的表达,并对hMSCs心肌向分化具有正向调控作用。     

hhlim对心肌肥大的影响及其作用机制探讨

hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程.用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入原代心肌细胞,发现该基因强制性表达可使心肌细胞体积明显增大.RT-PCR和蛋白质印迹结果表明,hhlim促心肌细胞肥大与诱导α-肌动蛋白(α-actin)过表达及重新启动胚胎期表达基因脑钠肽（BNP）表达有关.用可表达hhlim反义RNA的真核表达载体转染心肌细胞后,致心肌细胞肥大因子ET-1对BNP和α-actin表达的诱导受到显著抑制.这些结果表明,ET-1促进BNP和α-actin表达及引发心肌肥大的效应可能由hhlim所介导,提示hhlim表达与心肌细胞肥大的启动有关.单独或共转染转录因子hhlim、Nkx2.5、GATA-4表达质粒和BNP转录调控区指导的报告基因结果显示,hhlim强制性表达不仅能直接激活BNP基因表达,而且与NKx2.5具有协同作用.结果表明,hhlim可以通过直接或与Nkx2.5协同作用激活BNP基因的表达.     

全反式维甲酸体外诱导P19细胞向心肌方向分化

目的探讨不同浓度全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导P19细胞向心肌分化的效力。方法细胞分成P19细胞组,2nm/L atRA诱导组,5nm/L atRA诱导组,8nm/L atRA诱导组。各组细胞经过诱导、聚集培养、聚集体贴壁培养10天后,RT-PCR检测GATA-4,α-肌球蛋白重链(α-myosin heavychain,α-MHC)的mRNA表达,免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT蛋白共表达,Western blot检测cTnT的蛋白表达。结果 atRA可诱导聚集P19细胞表达GA-TA-4、a-MHC mRNA;α-sarcomeric actin和cTnT的表达和共表达增加;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组GATA-4、a-MHCmRNA的表达量显著高于P19细胞组;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组两种蛋白的表达和共表达量显著高于P19细胞组,以5nm/L atRA组最高,显著高于其它组。结论 atRA可诱导聚集P19细胞向心肌分化,其中5nm/L atRA组效果最好。     

大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的：研究体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化的潜能。方法：取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,分离培养MSCs,采用第二代或第三代MSC8,以5-氮杂胞苷（5-aza）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及两者联合作用,作为分化诱导剂,连续观察三周,相差显微镜下观察其形态变化。免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性蛋白T（Troponin T,cTnT）、连接蛋白43（Connexin43）、α-横纹肌动蛋白（α-Sarcomevic Actin）的表达,应用半定量RT—PCR技术分析Nkx2．5、GATA-4、TGF-？等相关调控基因在分化过程中的表达。结果：免疫细胞化学显示cTnT、Connexin43、α-Sarcomeric Actin诱导前无表达,单纯bFGF诱导组及对照组未发现cTnT、Connexin43、α-Sarcomevic Actin染色阳性细胞,单纯5-aza诱导组诱导后上述三种蛋白阳性细胞表达比例分别为22％、28％、32％,5-aza与bFGF联合诱导组诱导后上述三者阳性细胞表达比例分别为28％、33％、40％,联合诱导组诱导后细胞阳性率明显高于单纯5-aza诱导组,两组相比较差异有显著性意义（P〈0．05）。RT—PCR检测结果显示,GATA-4、Nkx2．5、TGF—β在诱导前的MSCs有低表达,单纯5-aza诱导组及5-aza与bFGF联合诱导组诱导后3周,这三种基因有较强的表达,单纯5-aza诱导组诱导检测结果显示,GATA-4、Nkx2．5、TGF—β在诱导前的MSCs有低表达,单纯5-aza诱导组及5-aza与bFGF联合诱导组诱导后3周,这三种基因有较强的表达,单纯5-aza诱导组诱导前后相比较,差异有显著性意义（P〈0．05）,5-aza与bFGF联合诱导组诱导前后相比较,差异也有显著性意义（P〈0．05）,单纯5-aza诱导组与5-aza和bFGF联合诱导组诱导后两组之间相比较,差异亦有显著性意义（P〈0．05）,表明单纯5-aza诱导及5—aza与bFGF联合诱导均可使MSCs向心肌细胞转化,联合诱导可以使更多的MSCs向心肌细胞方向转化。单纯bFGF诱导组诱导前后无显著性差异。结论：5-aza及bFGF联合诱导,可以作为更好的促进MSCs向心肌细胞分化的条件。     

A Comparative Study to Evaluate Myogenic Differentiation Potential of Human Chorion versus Umbilical Cord Blood-derived Mesenchymal Stem Cells

Objective

Musculodegenerative diseases threaten the life of many patients in the world. Since drug administration is not efficient in regeneration of damaged tissues, stem cell therapy is considered as a good strategy to restore the lost cells. Since the efficiency of myogenic differentiation potential of human Chorion- derived Mesenchymal Stem Cells (C-MSCs) has not been addressed so far; we set out to evaluate myogenic differentiation property of these cells in comparison with Umbilical Cord Blood- derived Mesenchymal Stem Cells (UCB-MSCs) in the presence of 5-azacytidine.

Priming with oxytocin and relaxin improves cardiac differentiation of adipose tissue–derived stem cells

Previous studies have identified the heart as a source and a target tissue for oxytocin and relaxin hormones. These hormones play important roles in the regulation of cardiovascular function and repair of ischemic heart injury. In the current study, we examined the impact of oxytocin and relaxin on the development of cardiomyocytes from mesenchymal stem cells. For this purpose, mouse adipose tissue–derived stem cells (ADSCs) were treated with different concentrations of oxytocin or relaxin for 4 days. Three weeks after initiation of cardiac induction, differentiated ADSCs expressed cardiac-specific genes, Gata4, Mef2c, Nkx2.5, Tbx5, α- and β-Mhc, Mlc2v, Mlc2a and Anp, and cardiac proteins including connexin 43, desmin and α-actinin. 10 ⁻⁷ M oxytocin and 50 ng/mL relaxin induced the maximum upregulation in the expression of cardiac markers. A combination of oxytocin and relaxin induced cardiomyocyte differentiation more potently than the individual factors. In our experiment, oxytocin-relaxin combination increased the population of cardiac troponin I-expressing cells to 6.84% as compared with 2.36% for the untreated ADSCs, 3.7% for oxytocin treatment and 3.41% for relaxin treatment groups. In summary, the results of this study indicated that oxytocin and relaxin hormones individually and in combination can improve cardiac differentiation of ADSCs, and treatment of the ADSCs and possibly other mesenchymal stem cells with these hormones may enhance their cardiogenic differentiation and survival after transplantation into the ischemic heart tissue.