艰难拟梭菌毒素致病机制及毒素基因调控的研究进展

艰难拟梭菌(Clostridioides difficile)是一种产芽孢的革兰氏阳性专性厌氧杆菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。艰难拟梭菌产生的毒素A和毒素B在其致病过程中发挥关键作用。毒素发挥毒性作用依赖其4个功能结构域：葡萄糖基转移酶结合域、半胱氨酸蛋白酶结合域、易位域和受体结合域。毒素的受体结合域识别并结合细胞表面受体,介导毒素内吞并形成内体。经过自体催化切割,毒素将真正的毒性片段——葡萄糖基转移酶结合域释放到胞浆中,葡萄糖基转移酶能够失活宿主肠上皮细胞内的GTP酶导致细胞骨架解聚和坏死,进而引起腹泻和伪膜性结肠炎等临床症状。艰难拟梭菌毒素产生受致病基因座内及基因座外许多调控因子的调节。tcdR和tcdC基因位于致病基因座内,对毒素基因的表达分别起促进和抑制作用,而基因座外如spo0A、codY等基因则通过抑制tcdR的表达从而间接影响毒素蛋白产生。本文将重点介绍艰难拟梭菌毒素的致病过程和影响毒素基因表达的分子调控机制,以期为开发针对毒素的治疗手段提供新思路。     

艰难拟梭菌毒素致病机制及毒素基因调控的研究进展

艰难拟梭菌(Clostridioides difficile)是一种产芽孢的革兰氏阳性专性厌氧杆菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。艰难拟梭菌产生的毒素A和毒素B在其致病过程中发挥关键作用。毒素发挥毒性作用依赖其4个功能结构域:葡萄糖基转移酶结合域、半胱氨酸蛋白酶结合域、易位域和受体结合域。毒素的受体结合域识别并结合细胞表面受体,介导毒素内吞并形成内体。经过自体催化切割,毒素将真正的毒性片段——葡萄糖基转移酶结合域释放到胞浆中,葡萄糖基转移酶能够失活宿主肠上皮细胞内的GTP酶导致细胞骨架解聚和坏死,进而引起腹泻和伪膜性结肠炎等临床症状。艰难拟梭菌毒素产生受致病基因座内及基因座外许多调控因子的调节。tcdR和tcdC基因位于致病基因座内,对毒素基因的表达分别起促进和抑制作用,而基因座外如spo0A、codY等基因则通过抑制tcdR的表达从而间接影响毒素蛋白产生。本文将重点介绍艰难拟梭菌毒素的致病过程和影响毒素基因表达的分子调控机制,以期为开发针对毒素的治疗手段提供新思路。     

中药复方对艰难梭菌毒素基因tcd A/tcd B体外表达的影响

目的探讨中药复方治疗抗生素相关性腹泻(antibiotic associated diarrhea,AAD)的药理机制。方法应用荧光定量PCR技术检测2种中药复方(参苓白术散和理中汤)对2株艰难梭菌临床分离株(A+B+和A-B+)体外培养下毒素基因表达的影响。结果在A+B+艰难梭菌中,参苓白术散组对tcd A和tcd B基因的表达均有显著或是完全抑制,理中汤也有显著的抑制;而对于A-B+艰难梭菌,2种中药复方则完全抑制tcd B基因的表达。结论通过影响毒素基因的表达可能是中药复方治疗AAD的药理学机制之一。     

ICU患者艰难梭菌分离培养与 流行病学特征研究

目的了解ICU患者艰难梭菌的定植和感染情况,为预防艰难梭菌的流行提供参考。方法收集2016年9月至2017年6月福建医科大学附属第一医院ICU中139例住院时间7d的患者的粪便样本,对其进行选择性厌氧培养和质谱鉴定。对艰难梭菌培养阳性标本进行毒素基因(tcdA、tcdB、cdt A、cdtB)的PCR检测以及毒素A、B表型检测。收集所有患者的临床资料,并对艰难梭菌培养阳性患者的临床特征和实验室检查结果进行单因素分析和多因素回归分析。结果艰难梭菌检出率为17.27%(24/139)。其中,14株艰难梭菌的tcdA和tcdB基因检测阳性,占58.3%(14/24);10株为tcdA和tcdB基因检测阴性,占41.7%(10/24)。所有菌株二元毒素基因(ctdA/ctdB)均未检出。单因素分析提示,高龄、长时间住院、高淋巴细胞数、使用β-内酰胺类抗生素是艰难梭菌定植的高危因素;多因素回归分析提示,使用β-内酰胺类抗生素是艰难梭菌定植的独立危险因素(OR=3.881,P=0.039)。结论我院ICU可能存在艰难梭菌感染和传播的风险,对具有高龄、长期住院以及使用抗生素等高危因素的患者应进行艰难梭菌的监测,以防艰难梭菌的传播、感染和艰难梭菌相关性腹泻的发生。     

3种检测艰难梭菌方法的临床应用评估

本研究旨在对3种检测粪便样本中艰难梭菌的方法进行临床应用评估,为艰难梭菌的实验室检测提供参考。采用艰难梭菌毒素A/B(Clostridium difficile toxins A and B,CDAB)酶联免疫荧光检测法、环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(cycloserin-cefoxitin-fructose agar,CCFA)常规培养法和显色培养法(chromID~(TM))同步检测粪便样本中的艰难梭菌,并对培养所得菌株进行tcdB基因扩增以验证其产毒性。以艰难梭菌培养联合tcdB基因扩增为参考方法,分别计算上述3种方法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等参数,分析其与参考方法的一致性。研究共收集临床粪便样本164份,参考方法检测结果为58份阳性,106份阴性。经统计分析,艰难梭菌毒素A/B法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为51.7%、95.3%、85.7%和78.3%,CCFA常规培养法分别为72.4%、98.1%、95.5%和86.7%,而艰难梭菌显色培养法分别为94.8%、92.5%、87.3%和97.0%。3种方法中,艰难梭菌显色培养法与参考方法的一致性最高(Kappa=0.856)。采用该方法检测粪便样本中的艰难梭菌操作简便,成本经济,结果判断直观、准确,具有较好的临床应用价值。     

艰难梭菌研究现状

艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)是产芽胞革兰阳性厌氧菌,产毒素艰难梭菌可导致艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)。产毒素艰难梭菌已被公认是抗菌药物相关性腹泻最常见的病原体,也是发达国家最常见的导致住院患者腹泻感染的原因之一。高毒力菌株导致全世界范围内CDI的发病率和死亡率增加。如何快速而准确地检测CD一直是备受关注的问题,国内外多推荐两步法和三步法进行检测。艰难梭菌治疗的一线用药是甲硝唑、万古霉素以及非达霉素,应用粪便微生物移植(faecal microbiota transplantation,FMT)也可作为治疗轻度或严重复发CDI(recurrence Clostridium difficile infection,rCDI)的可选方法。艰难梭菌的芽胞能抵抗不良环境,但抗菌药物的使用,医院环境的复杂性和医务工作者的手等因素会导致艰难梭菌易于传播,因此医疗机构应加强艰难梭菌的预防。本文主要对艰难梭菌的流行病学、致病机制、检测及治疗进行综述。     

艰难梭菌实验室快速鉴定方法检验效能的比较

目的评价3种艰难梭菌实验室鉴定方法的快速性及准确性。方法 2013年6月至2013年11月,收集136名ICU患者共248份标本进行24 h、48 h厌氧培养,并进行鉴定,同时对大便标本提取DNA进行tcd B毒素基因检测。以48 h培养结果为参考标准,评价24小时培养法和PCR扩增tcd B基因法鉴定艰难梭菌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果 136名ICU发生腹泻的患者中,11名患者共有12份标本48 h培养为艰难梭菌阳性,艰难梭菌感染率为8.09%(11/136),标本阳性率为4.84%(12/248)。24小时培养法及PCR扩增tcd B基因法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为75.00%、100%、100%、98.74%和83.33%、99.15%、83.33%、99.15%。结论提取大便DNA tcd B毒素基因是最快速、灵敏度和特异度均较高的方法;48小时培养法时间相对较长,但稳定可靠,并可以保留菌株进行后续试验;24小时培养法,时间短、简便但会漏诊某些阳性病例。     

上海部分地区儿童艰难梭菌相关性腹泻的临床分析

本文旨在监测儿童腹泻中艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)的发病情况,并对其进行回顾性临床分析。对复旦大学附属儿科医院2007年2月～9月111例腹泻患儿的粪便标本进行艰难梭菌毒素A检测及粪便厌氧菌培养,对所有患儿进行回顾性病史采集及分析,并对粪便培养所得的4株艰难梭菌菌株用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)技术进行同源性分析。111例患者中,艰难梭菌毒素A检测及艰难梭菌培养均为阳性者无,艰难梭菌毒素A阳性而艰难梭菌培养阴性者16例,艰难梭菌毒素A阴性而艰难梭菌培养阳性者4例,艰难梭菌毒素A及艰难梭菌培养均阴性者91例。比较院内、院外组3种不同病程腹泻CDAD的发病率,无显著差异。MLVA分析发现粪便培养得到的4株艰难梭菌菌株有部分同源性。结果提示,目前上海部分地区儿童CDAD发病情况为散发,但彼此之间有部分同源性;院内、外获得性腹泻的CDAD发病率无显著差异;艰难梭菌毒素A阳性或艰难梭菌培养阳性的病例在临床表现上与艰难梭菌毒素A阴性且艰难梭菌培养阴性的腹泻病例无显著差异。     

人艰难梭菌感染的致病机制与防治策略研究进展

艰难梭菌是一种非常重要的医院感染病原菌,其感染占抗菌素相关腹泻的10．25％,占抗菌素相关肠炎的50．75％,占抗菌素相关伪膜炎的90．100％。而且越来越多的证据表明艰难梭菌的感染与其它疾病,如活性关节炎、婴儿突发性死亡、溶血性尿毒症、坏死性肠炎、希施斯普龙病等有关。更糟糕的是艰难梭菌存在着复发性感染,15—20％的病人在成功治愈后会复发。近年来,随着强毒株的出现,艰难梭菌的感染率和发病率逐年上升,病情也越来越严重,由艰难梭菌感染引起的死亡率也成倍增加。到目前为止,艰难梭菌发病率升高的原因及其致病机制还有待进一步研究。由于艰难梭菌是一种孢子产生菌,对大部分抗菌素都有抗性,目前用于艰难梭菌防治的主要抗菌素甲硝唑和万古霉素的治疗效果也在不断下降,所以正确认识艰难梭菌的感染与流行,进一步了解其致病机制,寻找新的替代疗法已是迫在眉睫。本文对艰难梭菌感染和流行的病因进行了较为全面的分析,对其致病机制进行了深入的总结,并探讨了艰难梭菌防治的最新策略和方法,将有利于更好的认识和研究艰难梭菌,为艰难梭菌的防治提供新思路。     

腹泻患者艰难梭菌及其毒素A/B检出率分析

目的了解住院腹泻患者艰难梭菌及其毒素A/B的检出情况,为临床诊断抗生素相关性腹泻提供参考依据。方法收集2015年9月至2016年8月崇州市人民医院疑似抗生素相关性腹泻住院患者的粪便标本163份,用艰难梭菌快速检测试剂盒检测艰难梭菌特异性抗原谷氨酸脱氢酶(GDH);用酶联免疫荧光法检测GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B的产生情况。结果 163份粪便标本中GDH阳性为34份,阳性率为20.86%。34份GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B阳性率为41.18%(14/34),可疑阳性率为17.65%(6/34),阴性率为41.18%(14/34)。结论疑似抗生素相关性腹泻住院患者艰难梭菌GDH检出率较高,毒素A/B阳性率也比较高,提示临床应重视抗生素相关性腹泻患者艰难梭菌感染的诊断。     

艰难类梭菌芽胞形成和萌发相关调控的研究进展

艰难类梭菌(Clostridioides difficile)是一种革兰氏阳性、可产毒素的专性厌氧菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。芽胞是造成艰难类梭菌传播和感染复发的重要因素,其形成和萌发在感染的发展过程中起到重要作用。近年来,越来越多的艰难类梭菌芽胞形成和萌发的具体机制被阐明。本文就近年来艰难类梭菌芽胞形成和萌发的相关分子调控机制的研究进展进行综述,以期为开发针对芽胞的有效治疗手段提供思路。     

兰州地区腹泻患者艰难梭菌的感染状况调查

目的调查兰州地区腹泻患者中艰难梭菌的流行特点,揭示国内艰难梭菌感染的现况。方法通过细胞毒检测试验和酶联免疫吸附试验对206份临床粪便样品进行毒素检测。结果 206份粪便滤液经细胞毒检测有26份样品使非洲绿猴肾细胞（vero细胞）圆缩化,确认含有艰难梭菌毒素;经酶联免疫吸附试验有28份为阳性,其中23份与细胞毒检测结果一致,与细胞毒试验的符合率为88.5%。结论兰州地区住院腹泻患者中艰难梭菌感染率约为12.62%。     

兰州市婴幼儿艰难梭菌带菌状况

在兰州市随机采集的２１６名健康婴幼儿粪标本经分离并对其培养特性、菌落菌体形态特征、生化反应特性以及毒素原性等进行一系列检查,检出了３７人的粪便含有艰难梭菌（１０４─１０８／ｇ）,检出总阳性率为１７．１％,新生儿、婴儿及幼儿各年龄组的检出阳性率分别为１３．５％（１９／４１）、３３．３％（１３／３９）、１３．９％（５／３６）。３７株分离菌中毒素原性阳性者仅有８株（２１．６％）,均分布于婴儿与幼儿两组。新生儿１４１人中２７人的粪标本为胎粪,只有１人（３．７％）含艰难梭菌（２×１０６／ｇ）,但不产毒素。所有婴幼儿中有２２人因各种原因曾用过抗菌药物,但仅有２人的粪便含艰难梭菌,而且均为非产毒株,表明艰难梭菌检出率与药物服用之间似无显著的相关性。     

Variation in nuclear DNA content in an ex-type isolate of Penicillium measured by continuous flow microfluorimetry

Abstract The effect of purified enterotoxin produced by Clostridium difficile on Chinese hamster ovary (CHO) cells was examined. In a certain concentration range (0.9–3.6 μ g/ml), purified toxin caused CHO elongation, namely a cytotonic effect, which is similar to a typical morphological change in CHO cells induced by cholera enterotoxin. At a higher concentration, purified enterotoxin had a cytotoxic effect on CHO cells which was neutralized by anti- C. difficile enterotoxin, but not by anti- C. difficile cytotoxin. Thus, enterotoxin had both cytotonic and cytotoxic effects on CHO cells. About 60 and 180 min were required for binding of enterotoxin to CHO cells, and its internalization, respectively, both times being much longer than those for C. difficile cytotoxin.     

Detection of the ADP-ribosyltransferase toxin gene (cdtA) and its activity in Clostridium difficile isolates from Equidae

Clostridium difficile is an antibiotic-associated emerging pathogen of humans and animals. Thus far three toxins of C. difficile have been described: an enterotoxin (ToxA), a cytotoxin (ToxB) and an ADP-ribosyltransferase (CDT). In the present work we describe the first isolation of CDT producing C. difficile from Equidae with gastro-intestinal disease. Out of 17 C. difficile strains isolated from Equidae, 11 were positive for the genes tcdA and tcdB encoding ToxA and ToxB. In addition four of these 11 isolates were positive for the cdtA gene encoding the catalytic subunit of the ADP-ribosyltransferase CDT. Interestingly none of the isolates derived from canines (41 isolates) and felines (4 isolates) harboured the cdtA gene. In C. difficile field isolates which contained the cdtA gene, ADP-ribosyltransferase activity could also be detected in culture supernatants indicating expression and secretion of CDT. All strains were associated with intestinal disorders, but no association was found for the occurrence of toxins with a specific clinical diagnosis.     

粪菌移植治疗艰难梭菌感染的研究进展

艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)是院内抗生素相关性腹泻的最重要因素之一,其主要临床表现包括血便、腹泻、中毒性巨结肠、伪膜性肠炎等。近年来,CDI发病率、复发率、死亡率和治疗费用均明显增加,但其各种治疗方法均有局限性,尤其是抗生素治疗复发性艰难梭菌感染已面临许多棘手问题。目前证实肠道菌群失调和CDI感染关系密切,肠道菌群紊乱后导致艰难梭菌过度繁殖并释放毒素,可导致艰难梭菌感染。粪菌移植作为重建肠道菌群的重要方式,已成为复发性、难治性艰难梭菌感染最有效的治疗方式之一,不良反应极少。本文就国内外粪菌移植治疗艰难梭菌感染的研究进展作一综述。     

Comparative role of antibiotic and proton pump inhibitor in experimental Clostridium difficile infection in mice

Clostridium difficile inoculated BALB/c mice were investigated to assess the comparative role of antibiotic and proton pump inhibitor. They were examined for colonization and toxin production by C. difficile as well as myeloperoxidase activity and histopathological changes in the intestinal tract. The C. difficile count, toxin A and B titres and myeloperoxidase activity were significantly higher (P>0.05) in ampicillin and lansoprazole receiving groups as compared to the control and the C. difficile receiving groups. Similarly they showed significant difference (P >0.05) for epithelial damage, oedema and neutrophilic infiltrate in colons. In addition to antibiotic, PPI also acts as an independent risk factor for C. difficile infection in experimental studies.     

艰难梭菌耐药性及耐药机制研究进展

艰难梭菌(Clostridium difficile)是医疗保健相关性腹泻最主要的病原菌。2002年起欧美地区艰难梭菌感染发病率和病死率均明显增高,耐药艰难梭菌的出现和传播更给临床治疗和预防带来了挑战。绝大多数临床分离菌对甲硝唑及万古霉素仍呈高度敏感,但已有异质性耐药或最低抑菌浓度上升的报道;对红霉素和莫西沙星等其他抗菌药物的耐药率在不同国家和地区则有较大差异。艰难梭菌对甲硝唑或万古霉素敏感性下降产生的耐药机制尚不明确,而对红霉素、氟喹诺酮类、四环素和利福霉素形成的耐药机制主要是因为作用靶点发生了改变。文章简述了近年来国际上艰难梭菌耐药性及耐药机制方面的研究进展。     

Clostridium difficile has two parallel and essential Sec secretion systems

Protein translocation across the cytoplasmic membrane is an essential process in all bacteria. The Sec system, comprising at its core an ATPase, SecA, and a membrane channel, SecYEG, is responsible for the majority of this protein transport. Recently, a second parallel Sec system has been described in a number of gram-positive species. This accessory Sec system is characterized by the presence of a second copy of the energizing ATPase, SecA2; where it has been studied, SecA2 is responsible for the translocation of a subset of Sec substrates. In common with many pathogenic gram-positive species, Clostridium difficile possesses two copies of SecA. Here, we describe the first characterization of the C. difficile accessory Sec system and the identification of its major substrates. Using inducible antisense RNA expression and dominant-negative alleles of secA1 and secA2, we demonstrate that export of the S-layer proteins (SLPs) and an additional cell wall protein (CwpV) is dependent on SecA2. Accumulation of the cytoplasmic precursor of the SLPs SlpA and other cell wall proteins was observed in cells expressing dominant-negative secA1 or secA2 alleles, concomitant with a decrease in the levels of mature SLPs in the cell wall. Furthermore, expression of either dominant-negative allele or antisense RNA knockdown of SecA1 or SecA2 dramatically impaired growth, indicating that both Sec systems are essential in C. difficile.