友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定

【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。     

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达王峥,周蓓芸,郑幼霞（中国科学院上海植物生理研究所,２０００３）关键词高温放线菌,β—淀粉酶,基因克隆β—淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依次水解α－１,４葡萄糖昔键,产生分构型的麦芽糖。内...     

拟南芥海藻糖酶基因克隆及其在大肠杆菌中高效表达与功能研究

从拟南芥幼苗中提取RNA,通过RT-PCR克隆得到海藻糖酶基因后,将其构建到原核高效表达载体pET30a( )上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,继而对纯化得到的海藻糖酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究.实验结果表明,植物源的海藻糖酶基因在异体大肠杆菌中能够高效表达,纯化获得的海藻糖酶蛋白在试管条件下具有较高的海藻糖水解活性,其活性最适温度为45℃.通过GC-MS分离检测,可以明显地看到酶反应过程中底物海藻糖和产物葡萄糖的含量随反应时间变化的消长关系,这充分证明克隆基因在大肠杆菌中的表达产物具有海藻糖酶的功能.     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

嗜热地芽胞杆菌(Geobacillus kaustophilus)DY115普鲁兰酶基因的克隆、表达和酶学性质

采用基因工程方法对嗜热地芽胞杆菌(Geobacillus kaustophilus)DY115的普鲁兰酶基因pulA在大肠杆菌中进行了克隆表达。该基因ORF全长为2 157bp,编码718个氨基酸。重组PulA在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中能够有效表达,经Ni-Sepharose亲和层析获得纯化的重组PulA蛋白。PulA最适作用温度为70℃,最适pH为8.0,在65℃和碱性条件下具有良好的热稳定性;K~+和Mn~(2+)对PulA活性有明显促进作用,Cu~(2+)和Zn~(2+)则强烈抑制PulA活性;PulA对普鲁兰糖水解能力最强,且其水解支链淀粉和糯米淀粉的能力明显高于直链淀粉;PulA可水解普鲁兰糖的α-(1,6)糖苷键生成麦芽三糖,属于I型普鲁兰酶。这是首次对来源于地芽胞杆菌属(Geobacillus)的高温碱性普鲁兰酶进行报道,由于PulA具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

兽疫链球菌透明质酸合成相关基因hasB的克隆以及性质研究

透明质酸是链球菌荚膜的主要组成部分,有着重要的生理功能。UDP-葡萄糖脱氢酶(HasB)是透明质酸合成中的一个关键酶,而C类链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因(hasB)尚未被克隆。通过hasB基因的上下游序列设计引物从兽疫链球茵的基因组中克隆出一段序列,测序结果显示其包含一个由1206个碱基组成的开放阅读框,所编码的蛋白序列同化脓链球菌和乳链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶蛋白序列分别有63．1％和70．6％的相似性。将这段基因置于T7启动子下,并在大肠杆菌中进行表达,能够得到一个约47kDa的蛋白,酶活测定显示其具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性。这些结果表明所克隆的基因是兽疫链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因。     

人FGF-21基因的克隆、表达及其调节脂肪细胞糖代谢的活性

成纤维细胞生长因子FGF-21是FGF家族的一个新成员, 最近的研究发现其具有调节血糖的作用, 有望成为治疗2型糖尿病的基因药物。文章应用RT-PCR技术, 从成人肝脏中克隆人源的FGF-21成熟蛋白基因, 并将其克隆到T载体上, 经测序鉴定后, 将其亚克隆到原核表达载体pSUMO上, 转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中。鉴定阳性克隆后, 用IPTG诱导FGF-21表达, 并用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化。以3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收实验来鉴定FGF-21表达产物促进糖吸收的活性。结果表明, FGF-21成熟蛋白基因大小为546 bp, 测序结果与GenBank数据库中的序列一致。SDS-PAGE与Western blotting结果表明: 人源FGF-21成熟蛋白大小19.4 kDa, 经3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收实验验证其具有促进葡萄糖吸收的生物活性, 并且GLUT1是FGF-21发挥生物学作用的终末执行单位。     

嗜热地芽胞杆菌(Geobacilluskaustophilus)DY115普鲁兰酶基因的克隆、表达和酶学性质

采用基因工程方法对嗜热地芽胞杆菌(Geobacillus kaustophilus)DY115的普鲁兰酶基因pulA在大肠杆菌中进行了克隆表达。该基因ORF全长为2 157bp,编码718个氨基酸。重组PulA在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中能够有效表达,经Ni-Sepharose亲和层析获得纯化的重组PulA蛋白。PulA最适作用温度为70℃,最适pH为8.0,在65℃和碱性条件下具有良好的热稳定性;K+和Mn2+对PulA活性有明显促进作用,Cu2+和Zn2+则强烈抑制PulA活性;PulA对普鲁兰糖水解能力最强,且其水解支链淀粉和糯米淀粉的能力明显高于直链淀粉;PulA可水解普鲁兰糖的α-(1,6)糖苷键生成麦芽三糖,属于I型普鲁兰酶。这是首次对来源于地芽胞杆菌属(Geobacillus)的高温碱性普鲁兰酶进行报道,由于PulA具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

乌桕SsSAD基因的原核表达与纯化研究

乌桕是一种重要的木本油料树种。SAD(stearoyl-acyl ACP desaturase)是油料植物中将饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸的一种关键脱氢酶。为了进一步揭示乌桕SsSAD的功能,该研究在大肠杆菌中表达了该蛋白。结果表明:(1)通过RT-PCR的方法从乌桕种子中克隆出了SsSAD基因编码区全长序列,并将其克隆到低温诱导的原核表达载体pCold TF上,构建原核重组表达载体pCold TF/SsSAD,转化大肠杆菌BL 21star(DE3)并获得原核表达工程菌株。(2)通过IPTG法低温诱导表达融合蛋白。该重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,融合蛋白分子质量约为101kD,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了重组蛋白,上述结果为进一步研究乌桕SsSAD的结构和功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体(ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-E2-ScFv.以重组的HCVE2蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-E2-ScFv基因的噬菌体克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经Ncol/NotI酶切鉴定后,该ScFv基因由750bp组成,将其亚克隆到pCANTAB5E载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DNA序列测定,符合ScFv的基因结构特点.IPTG诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCVE2单链可变区抗体的表达.酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV-E2-ScFv具有与重组HCVE2蛋白的反应活性和特异性,对转化的JM109大肠杆菌上清中表述的HCV-E2-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),证实表达的HCV-E2-ScFv的分子量为28kD.为应用HCV-E2-ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础.