丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体(ScFv)的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109中表达可溶性的HCV-E2-ScFv.以重组的HCVE2蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有HCV-E2-ScFv基因的噬菌体克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经Ncol/NotI酶切鉴定后,该ScFv基因由750bp组成,将其亚克隆到pCANTAB5E载体中,转化大肠杆菌JM109,提取质粒进行DNA序列测定,符合ScFv的基因结构特点.IPTG诱导转化的大肠杆菌JM109,在其培养上清中获得了可溶性HCVE2单链可变区抗体的表达.酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV-E2-ScFv具有与重组HCVE2蛋白的反应活性和特异性,对转化的JM109大肠杆菌上清中表述的HCV-E2-ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),证实表达的HCV-E2-ScFv的分子量为28kD.为应用HCV-E2-ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础.     

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

采用噬菌体表面展示技术,以从乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体(ScFv)克隆并提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌XL1-Blue。经IPTG诱导后,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50%硫酸胺沉淀,经SDS-PAGE电泳表明,XL1-Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28?kD。免疫活性检测结果表明,该单链抗体具有较强的抗原结合活性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

基因工程疫苗的病毒载体

病毒基因工程疫苗是以活病毒为载体将一段外源基因导入机体细胞内,并使外源基因维持较高水平的表达。通过使用复制型或复制缺陷型载体能使表达的抗原诱生机体产生相应的体液抗体,并能引起机体产生细胞介导的免疫反应及粘膜免疫反应。本文主要介绍有可能用于基因工程疫苗的DNA及RNA病毒载体构建及其应用。     

戊型肝炎病毒亚基因组RNA的研究

本文利用同位素代谢标记在HEV感染85～10.5,6.5～7.5h分别检测到1及2个亚基因组RNA,而感染21h后及在成熟的病毒颗粒内未能检测到亚基因组RNA。通过杂交实验,发现HEV的亚基因组RNA具有典型的共3′端的半套式结构,且基因组RNA与亚基因组RNA的5′端不存在共同的引导序列。通过紫外转录图谱发现HEV的亚基因组RNA是通过独立转录的方式产生的。利用引物延伸反应发现两种亚基因组RNA的转录起始位点分别位于RNA聚合酶区及非结构区、结构区的基因间序列。