乙酰胆碱酯酶的别构作用:两类胆碱能配基在外周阴离子部位的颉颃

纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶,在低离子强度介质中,底物(硫代丁酰胆碱)浓度和活性的关系符合Michaelis 方程。底物在外周阴离子部位的结合不抑制酶活性。然而,底物按Kss 值(底物在外周结合作用的解离常数)解除箭毒和阿托品对酶的纯非竞争性抑制作用。与箭毒类似的胆碱能配基还有1,5-双-(4-三甲铵苯)戊酮-3及十甲鎓。但它们对酶的催化阴离子部位也有很高的亲和力。我们测定了它们作用于酶上两类部位的抑制常数。另一类胆碱能配基,包括硫代丁酰胆碱、乙酰胆碱、苯酰胆碱、间-三甲铵酚、烟碱、六甲鎓和季铵酚,除了它们在酶的催化阴离子部位有较高的亲和力外,也结合于外周部位,并表现为解除箭毒抑制的颉颃作用。其中某些化合物在外周结合后也有别构激活作用。从这些结果能假定,酶至少可存在三种构象状态。讨论了乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体的某些相似性。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用——某些胆碱能效应剂与钙离子激活作用的关系

钙离子对纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的激活作用是依赖于底物浓度的。在钙离子存在时,表现最高活力的底物浓度在0.3mM 左右,随着底物浓度的增高,激活作用消失。钙离子与酶结合作用的表观解离常数为6×10~(-4)M 左右。钙离子浓度的增加并不解除底物对钙离子激活作用的抑制,表明钙离子似不可能结合在酶的外周底物结合部位。非竞争性抑制剂箭毒,在酶的外周阴离子部位有表现不同亲和力的两种结合作用,只有其中高亲和力的抑制作用为钙离子解除。在箭毒接近全抑制酶活性以后,再增加箭毒浓度,钙离子仍表现竞争作用。箭毒对酶的两种不同的抑制作用皆为底物所解除。竞争性与非竞争性混合类型抑制剂十甲鎓及1,5-双-(4-三甲铵苯)戍酮-3的抑制作用部份地为钙离子解除。讨论了包括钙离子及硫代丁酰胆碱、箭毒、十甲鎓、1,5-双(4-三甲铵苯)戊酮-3、季铵酚和六甲鎓在内的多种胆碱能配基在酶上三类部位的结合及配基间的相互作用。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用——某些胆碱能效应剂与钙离子激活作用的关系

钙离子对纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的激活作用是依赖于底物浓度的。在钙离子存在时,表现最高活力的底物浓度在0.3mM左右,随着底物浓度的增高,激活作用消失。钙离子与酶结合作用的表观解离常数为6×10~(-4)M左右。钙离子浓度的增加并不解除底物对钙离子激活作用的抑制,表明钙离子似不可能结合在酶的外周底物结合部位。非竞争性抑制剂箭毒,在酶的外周阴离子部位有表现不同亲和力的两种结合作用,只有其中高亲和力的抑制作用为钙离子解除。在箭毒接近全抑制酶活性以后,再增加箭毒浓度,钙离子仍表现竞争作用。箭毒对酶的两种不同的抑制作用皆为底物所解除。竞争性与非竞争性混合类型抑制剂十甲鎓及1,5-双-(4-三甲铵苯)戊酮-3的抑制作用部份地为钙离子解除。讨论了包括钙离子及硫代丁酰胆碱、箭毒、十甲鎓、1,5-双(4-三甲铵苯)戊酮-3、季铵酚和六甲鎓在内的多种胆碱能配基在酶上三类部位的结合及配基间的相互作用。     

5,5′-联硫-2,2′-双硝基苯甲酸及其有关化合物对乙酰胆碱酯酶的别构效应

5,5'-联硫-2,2'-双硝基苯甲酸(DTNB)及其有关化合物TNB、TNB-Tch都是黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的别构效应剂: 1.TNB非竞争性地抑制、而DTNB则激活该酶水解乙酰硫代胆碱和丁酰硫代胆碱的活力。对水解乙酰胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆无影响。2.TNB-Tch比TNB具有更强的抑制作用。且对该酶水解乙酰胆碱、乙酰硫代胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆有抑制作用。抑制类型与作用底物有关。底物在外周的结合能解除其抑制。3.钙离子可以解除TNB和TNB-Tch的抑制作用,而箭毒亦能与之对抗。对蛇毒乙酰胆碱酯酶,除了极低浓度(<10μM)DTNB和TNB有微弱的抑制作用外,TNB-Tch以及较高浓度的DTNB和TNB都具有强烈的激活作用。而对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的活力皆无影响。     

5,5′-联硫-2,2′-双硝基苯甲酸及其有关化合物对乙酰胆碱酯酶的别构效应

5,5'-联硫-2,2'-双硝基苯甲酸~*(DTNB)及其有关化合物TNB~(**)、TNB-Tch~(**)都是黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的别构效应剂:1.TNB 非竞争性地抑制、而DTNB 则激活该酶水解乙酰硫代胆碱和丁酰硫代胆碱的活力。对水解乙酰胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆无影响。2.TNB-Tch 比TNB 具有更强的抑制作用。且对该酶水解乙酰胆碱、乙酰硫代胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆有抑制作用。抑制类型与作用底物有关。底物在外周的结合能解除其抑制。3.钙离子可以解除TNB 和TNB-Tch 的抑制作用,而箭毒亦能与之对抗。对蛇毒乙酰胆碱酯酶,除了极低浓度(<10 μM)DTNB 和TNB 有微弱的抑制作用外,TNB-Tch 以及较高浓度的DTNB 和TNB 都具有强烈的激活作用。而对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的活力皆无影响。     

三种双季铵化合物对乙酰胆碱酯酶梭曼膦酰化和老化的影响

本文研究了六甲溴铵(C_6)、十甲溴铵(C_(10))和百草枯(paraquat或PQ)对电鳐电器官乙酰胆碱酯酶的作用。C_6是酶的完全竞争性抑制剂,它对梭曼膦酰化酶的老化反应有明显的延缓作用;C_(10)对酶的抑制分为两相,A相为完全竞争性抑制,B相为混合型抑制,它对老化只有轻微的延缓作用;PQ为酶的激活剂,而它对老化几乎无影响。概据这些结果可以设想,酶的活性区域的阴离子部位在梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶的老化中起重要作用。     

新疆棉铃虫对溴氰菊酯和硫丹 抗性的生化机理研究

通过生物测定和生化分析研究了新疆棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)敏感种群和室内筛选获得的抗性种群对硫丹和溴氰菊酯的反应及其α-乙酸萘酯酶和乙酰胆碱酯酶的动态活性反应。结果表明,筛选后新疆棉铃虫对硫丹和溴氰菊酯产生的抗性倍数分别为13倍和66倍。两个抗性种群的α-乙酸萘酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力均高于敏感种群。相应杀虫剂预处理后,α-乙酸萘酯酶酶活力受到抑制。抗性种群的α-乙酸萘酯酶对底物的亲和力高于敏感种群,但Vmax低于敏感种群。抗性种群的乙酰胆碱酯酶对底物的亲和力显著低于敏感种群,Vmax比敏感种群高。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,两个抗性种群都有一条特异性酶带,其迁移率相近,且均可被甲基对氧磷抑制。因此推测,α-乙酸萘酯酶参与了新疆棉铃虫对硫丹和溴氰菊酯的抗性,具有代谢和阻断作用;乙酰胆碱酯酶对抗性的产生也起到了重要作用。     

M-胆碱药物对大鼠皮层、腮腺和豚鼠小肠纵肌中 M-乙酰胆碱受体的作用比较

本文应用[~3H]-QNB 为放射性配基,研究 M-胆碱激动剂或阻滞剂对大鼠脑皮层、腮腺和豚鼠小肠纵肌中 M-乙酰胆碱受体竞争结合的影响。经量-效比式计算后,证明它们的作用斜率(b)约为1,表明它们作用在相同的 M-乙酰胆碱受体。阻滞剂对皮层中 M-胆碱受体的抑制结合强度次序为:QNB>阿托品,东莨菪碱>苯海索>M-8218>B-7601>M-8225>7911;而它们对腮腺中 M-乙酰胆碱受体的抑制作用次序有明显不同,即 M-8218>QNB>7911>M-8225>B-7601>苯海索>阿托品>东莨菪碱,其中阿托品和东莨菪碱的抑制结合强度分别为皮层的1/111和1/315。这提示不同靶细胞中的 M-乙酰胆碱受体与相同配基结合时有不同的专一性。试验证明包公藤甲素抑制[~3H]-QNB 的结合作用与毛果芸香碱相似,它们均为激动剂,对受体的亲和力比阻滞剂弱1000倍左右。     

浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅰ.酶的纯化

用亲和层析法纯化眼镜蛇毒胆碱酯酶440倍左右,比活力达到203毫克分子底物水解/小时/毫克蛋白。亲和吸附剂的制备是以琼脂糖凝胶4B为载体,己二胺为“手臂”,(间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成,不同长度的“手臂”对酶的吸附有影响,疏水性强的“手臂”对酶的吸附也强。在纯化过程中,胆碱酯酶在凝胶电泳中始终保持6条条带,可能是它的同工酶。兔抗眼镜蛇蛇毒血清对猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶、黄姑鱼肌肉胆碱酯酶无免疫交叉反应,对蛇毒胆碱酯酶形成络合物后仍能表现胆碱酯酶的活力,说明酶的抗原决定簇和活性中心不在同一部位。     

浙江产眼镜蛇毒胆碱酯酶的研究——Ⅰ.酶的纯化

用亲和层析法纯化眼镜蛇毒胆碱酯酶440倍左右,比活力达到203毫克分子底物水解/小时/毫克蛋白。亲和吸附剂的制备是以琼脂糖凝胶4B 为载体,己二胺为“手臂”,(间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成,不同长度的“手臂”对酶的吸附有影响,疏水性强的“手臂”对酶的吸附也强。在纯化过程中,胆碱酯酶在凝胶电泳中始终保持6条条带,可能是它的同工酶。兔抗眼镜蛇蛇毒血清对猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶、黄姑鱼肌肉胆碱酯酶无免疫交叉反应,对蛇毒胆碱酯酶形成络合物后仍能表现胆碱酯酶的活力,说明酶的抗原决定簇和活性中心不在同一部位。     

繁殖寄主对赤眼蜂羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的影响

通过测定赤眼蜂Trichogramma羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性、对底物的亲和力以及对抑制剂的敏感度研究了繁殖寄主对松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi和螟黄赤眼蜂T.chilonis的影响。柞蚕卵和米蛾卵繁殖的赤眼蜂羧酸酯酶对底物的亲和力有不同程度的影响,柞蚕卵繁殖的赤眼蜂羧酸酯酶对α-乙酸萘酯或β-乙酸萘酯的亲和力最高是米蛾卵的2倍以上。繁殖寄主对乙酰胆碱酯酶对底物亲和力没有明显的影响。米蛾卵繁殖的松毛虫赤眼蜂羧酸酯酶活性明显高于柞蚕卵繁殖的种群,而米蛾卵繁殖的螟黄赤眼蜂种群羧酸酯酶的活性明显低于柞蚕卵繁殖的种群。用柞蚕卵繁殖的松毛虫赤眼蜂种群对对氧磷的敏感度明显低于米蛾卵繁殖的种群,而增效磷则正好相反。繁殖寄主对松毛虫赤眼蜂吉林种群乙酰胆碱酯酶对DDVP和毒扁豆碱的敏感度没有明显的影响,而在松毛虫赤眼蜂广东种群和螟黄赤眼蜂中,柞蚕卵繁殖的种群乙酰胆碱酯酶对DDVP和毒扁豆碱的敏感度明显低于米蛾卵繁殖的种群。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过量底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5′-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

磷脂对乙酰胆碱酯酶的稳定性及磷酸化作用的影响

采用重组的方法,磷脂能显著地提高纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶在水溶液中保存的稳定性。牛脑磷脂酰丝氨酸及牛脑磷脂酰胆碱重组酶,在4℃条件下保存,皆有比对照更高的稳定性。酶与牛脑磷脂酰胆碱重组后,再分别于室温及37℃放置50天,其活力不下降。而对照的活力分别下降为重组前活力的1/2及1/4。在某些稀释条件下,牛脑及牛脊髓磷脂酰丝氨酸重组酶的活性迅速下降。稀释液中钙离子的存在,能阻止这种磷脂对酶的抑制作用。而磷脂酰胆碱重组酶及对照酶皆无此种在稀释条件下的活力迅速下降的现象。牛脑磷脂酰胆碱与酶的重组还能提高对氧磷与酶的反应活性。该重组酶与对氧磷反应的双分子速度常数高达9.0×10~8M~(-1)分~(-1)。因此,此种磷脂酰胆碱重组酶是酶分析法测定极低浓度有机磷化合物的一种较好的酶源。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH 在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH 从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill 系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过景底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5'-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

磷脂对乙酰胆碱酯酶的稳定性及磷酸化作用的影响

采用重组的方法,磷脂能显著地提高纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶在水溶液中保存的稳定性。牛脑磷脂酰丝氨酸及牛脑磷脂酰胆碱重组酶,在4℃条件下保存,皆有比对照更高的稳定性。酶与牛脑磷脂酰胆碱重组后,再分别于室温及37℃放置50天,其活力不下降。而对照的活力分别下降为重组前活力的1/2及1/4。在某些稀释条件下,牛脑及牛脊髓磷脂酰丝氨酸重组酶的活性迅速下降。稀释液中钙离子的存在,能阻止这种磷脂对酶的抑制作用。而磷脂酰胆碱重组酶及对照酶皆无此种在稀释条件下的活力迅速下降的现象。牛脑磷脂酰胆碱与酶的重组还能提高对氧磷与酶的反应活性。该重组酶与对氧磷反应的双分子速度常数高达9.0×10~8M~(-1)分~(-1)。因此,此种磷脂酰胆碱重组酶是酶分析法测定极低浓度有机磷化合物的一种较好的酶源。     

抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫毒力的影响及对乙酰胆碱酯酶的诱导作用

辛硫磷、马拉硫磷和灭多威3种抗胆碱酯酶剂亚致死剂量（LD10）预处理棉铃虫Helicoverpa armigera 3龄幼虫24 h后,对辛硫磷、马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯和高效氯氰菊酯5种杀虫药剂的毒力影响有明显差异。酶动力学研究表明：在48 h内,辛硫磷亚致死剂量对棉铃虫乙酰胆碱酯酶比活力有一定的抑制作用,24 h仅为对照组的0.56倍;马拉硫磷、灭多威则可以诱导乙酰胆碱酯酶的比活力增加,诱导最大值时间分别为3 h和12 h。通过对米氏常数（K_m）值分析表明,辛硫磷诱导48 h内对乙酰胆碱酯酶与底物亲和力的影响不大,马拉硫磷、灭多威诱导48 h内乙酰胆碱酯酶对底物亲和力有所下降,其中灭多威诱导组最为明显。3种药剂亚致死剂量处理24 h后,通过蔗糖密度梯度离心表明5%蔗糖梯度层乙酰胆碱酯酶分布百分数明显高于对照组,而20%蔗糖梯度层却明显低于对照组,说明亚致死剂量处理可能引起乙酰胆碱酯酶分子型及不同分子型分布比例的变化。     

圣草酚对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制

目的:探讨圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用MTT法筛选圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞损伤的有效保护浓度,进一步采用流式细胞术检测圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞的凋亡率的影响,并通过试剂盒检测圣草酚对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞胆碱能系统受体活性的影响。结果:MTT结果显示2×10~(-3)μmol/L圣草酚可显著促进Aβ2_(25-35)诱导的PC12细胞增殖(P0.05)。流式细胞术结果显示2×10~(-3)μmol/L圣草酚和雌二醇均可以显著抑制Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡(P0.05),提高其乙酰胆碱及乙酰胆碱转移酶活性并且降低乙酰胆碱酯酶的活性(P0.05),且二者的作用相当,差异无统计学意义(P0.05)。结论:圣草酚可能通过提高Ach及ChAT的含量,降低AchE的含量,调节胆碱能系统相关酶的活性,发挥对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞的保护作用。     

抗体对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的热稳定性的影响

采用不同的固定化方法制备了三种固定化猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶,其中琼脂糖-抗体-乙酰胆碱酯酶热稳定性最好。抗体与热稳定性最差的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶反应后,酶的热稳定性明显提高。抗体还能部分恢复热失活的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶的活力。酶与抗体反应前后的表观米氏常数K_m 及反应速度没有明显变化,表明抗体是结合在酶的非活性部位,没有或很少影响酶的活性中心的构象。     

抗体对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的热稳定性的影响

采用不同的固定化方法制备了三种固定化猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶,其中琼脂糖-抗体-乙酰胆碱酯酶热稳定性最好。抗体与热稳定性最差的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶反应后,酶的热稳定性明显提高。抗体还能部分恢复热失活的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶的活力。酶与抗体反应前后的表观米氏常数K_m及反应速度没有明显变化,表明抗体是结合在酶的非活性部位,没有或很少影响酶的活性中心的构象。     

邯郸地区棉铃虫抗药性的一些生物化学特性(英文)

对河北邯郸地区的抗性棉铃虫(Helicovrpa armigera H(?)bner)种群不同发育阶段乙酰胆碱酯酶(AChE)对灭多威和对氧磷的敏感磷的敏感度结果表明:4-5龄幼虫的AChE在棉铃虫整个发育期中敏感度是最低的,成虫期的AChE最敏感,蛹期AChE平均敏感度低于幼虫期。用甲基对硫磷和灭多威以LD_5的诱导剂量和LD_(50)的选择剂量处理棉铃虫幼虫后,AChE对底物的亲和力和对抑制剂的敏感度发生了明显的变化,水解β-乙酸萘酯的羧酸酯酶对底物的亲和力明显提高,而水解α-乙酸萘酯的羧酸酯酶对底物的亲和力在处理后24小时无明显改变。谷胱甘肽-S-转移酶活性,低剂量诱导组最高降低至78％和43％,而高剂量选择组提高15％,诱导组和选择组对底物的亲和力均明显降低,处理的剂量和处理后时间明显地影响棉铃虫磷酸酯酶的活性及其对底物的亲和力。