外加肌醇对嗜鞣管囊酵母发酵的酒精产量及其耐酒精能力的影响

嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)是可以同时发酵葡萄糖和木糖为酒精的菌种,在其生长和发酵培养基中分别添加不同浓度((0～200mg/L)的肌醇以及不同起始浓度的酒精,以考察外加肌醇对嗜鞣管囊酵母生长、产酒精能力和耐酒精能力的影响.结果 表明,添加肌醇前后,嗜鞣管囊酵母的生物量及发酵的酒精产量均有所增加.外加肌醇对嗜鞣管囊酵母生长有轻微的刺激作用,酵母生长最适肌醇浓度为150mg/L;而对酵母生长的耐酒精能力却有明显的影响, 并且,菌种在YEPD培养基中的耐酒精能力高于在YEPX培养基中的耐酒精能力.经实验测定,肌醇对嗜鞣管囊酵母产酒精能力及发酵的耐酒精能力均有显著的影响.发酵培养基中未添加起始浓度的酒精时,菌种发酵的最适肌醇浓度为100mg/L,此时生成的酒精产量为45.20g/L.当分别添加起始酒精浓度为10%和12%时,随着肌醇浓度的增加,菌种发酵生成的酒精浓度均呈上升趋势;肌醇浓度为200mg/L时,两种起始酒精浓度下,酒精的净生成量均达到最大,分别为17.18g/L和16.68g/L.     

膜蛋白氨基酸组成通过改变膜流动性影响粟酒裂殖酵母和酿酒酵母融合株耐酒精能力

实验显示,一种氨基酸混合液（含异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸,添加浓度分别为1.0、0.5和2.0g/L）能显著提高自絮凝酵母——粟酒裂殖酵母和酿酒酵母融合株SPSC的耐酒精能力。实验将菌体分别培养于添加（试验组）和未添加（对照组）该氨基酸混合液的条件下,然后收集菌体进行酒精（20%,V/V）冲击试验（30℃,9h）,结果,试验组的菌体尚有一半以上的存活细胞,而对照组的菌体全部死亡。通过对试验组和对照组的菌体细胞膜蛋白质氨基酸组成分析发现,试验组的菌体耐酒精能力提高与所添加氨基酸组入菌体的细胞膜密切相关。以DPH为荧光探针的细胞膜流动性测定分析进一步揭示,氨基酸组入菌体的细胞膜后,细胞膜能有效抵抗高浓度酒精冲击诱发的膜流动性的提高,从而维持膜的稳定。因此,实验首次揭示膜蛋白氨基酸组成可通过改变膜流动性而影响酵母菌的耐酒精能力。     

细胞膜蛋白质氨基酸组成对自絮凝颗粒酵母耐酒精能力的影响及作用机制

揭示细胞膜组分与酵母菌耐酒精能力的一种新颖关系及其机制。实验显示 ,培养于添加和未添加 3种氨基酸 (异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸 ,添加浓度分别为 1 0、0 5和 2 0g L)条件下的自絮凝颗粒酵母于 30℃经2 0 % (V V)酒精冲击 9h的存活率分别为 5 7%和 0 ,表明添加该 3种氨基酸能显著提高菌体的耐酒精能力。细胞膜蛋白质氨基酸组成分析和细胞膜流动性测定表明 ,所添加 3种氨基酸是通过组入菌体细胞膜、改变细胞膜流动性从而提高菌体的耐酒精能力的 ,即当细胞膜蛋白质氨基酸组成中异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸含量明显增加时 ,菌体能有效抵抗高浓度酒精冲击引发的细胞膜流动性的升高 ,从而维持细胞膜的稳定。细胞膜蛋白质氨基酸组成会影响细胞膜的流动性 (膜蛋白中异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸含量明显增加时膜流动性降低 )是一种新的实验现象。     

重组大肠杆菌产角质酶-CBM摇瓶发酵优化及分泌表达研究

在TB培养基的基础上,通过单因素分析和正交设计对重组大肠杆菌产角质酶-CBM发酵进行优化,得到最适培养基的组分为:甘油5 g/L,蛋白胨 16 g/L,MgSO₄·7H₂O 2.5 mmol/L,K₂HPO₄ 13.7 g/L,KH₂PO₄ 1.53 g/L,菌体生长至对数前中期时添加终浓度为1 g/L乳糖 和0.75 g/L 甘氨酸,30℃发酵48 h,角质酶-CBM产量可达63 U/ml,较TB培养(20 U/ml)提高了近3倍。考察了热激作用、渗透调节物质及温度两控制对角质酶-CBM分泌表达的影响,在添加Lactose和Glycine后,发现在添加终浓度为75 mmol/L的L-脯氨酸,37℃热激1 h或47℃热激0.5 h,变温至25℃发酵,角质酶-CBM产量可达90 U/ml,较TB恒温培养提高了近四倍。     

细胞膜磷脂脂肪酸组成对自絮凝酵母质膜ATP酶响应酒精刺激的影响及其与菌体耐酒精的关系

研究揭示细胞膜磷脂脂肪酸组成与质膜ATP酶在酵母菌耐酒精中的一种新颖关系。实验表明,细胞膜磷脂脂肪酸组成特点对生长于未添加酒精条件下的自絮凝颗粒酵母质膜ATP酶活性没有影响,但却明显影响生长于添加酒精(1％～10％,V／V)条件下的菌体质膜ATP酶对酒精激活的敏感性：预培养于添加0．6mmol／L棕榈酸、亚油酸、或亚麻酸条件下的菌体的质膜ATP酶的最大激活水平分别为各自酶的基态水平(未激活)的3．6、1．5和1．2倍,而对照组(预培养于未添加脂肪酸条件下的菌体)的相应值为2．3倍,酶产生上述最大激活水平时的酒精浓度分别为7％、6％、6％、和7％(V/V)。酶激活后米氏常数Km、最适pH和对钒酸钠(质膜ATP酶特异性抑制剂)的敏感性等性质不变,但最大反应速度υmax明显增加。实验表明,细胞膜磷脂脂肪酸组成特点对提高菌体的耐酒精能力越有利,则其质膜ATP酶被酒精激活的幅度越大,说明菌体耐酒精能力的提高与其质膜ATP酶对酒精激活的敏感性的增加密切相关。细胞膜磷脂脂肪酸组成会影响酵母菌质膜ATP酶对酒精激活的敏感性是观察到的新的实验现象。     

木薯粉与甘蔗糖蜜混合发酵高浓度酒精

对木薯粉与甘蔗糖蜜混合原料发酵高浓度酒精的条件进行了优化,先应用P-B(Plackett-Burman)试验筛选影响混合原料高浓度酒精发酵的重要影响因素,结果表明,初始总糖浓度、糖蜜添加时间、初始pH值是影响混合原料酒精发酵的重要因素。采用最陡爬坡实验找到响应面试验的中心点,再利用Box-Behnken设计确定重要参数的最佳水平。各因素的最佳水平是:总糖浓度为29.14%,添加时间为16.5 h,初始pH值为4.7。1 L发酵罐验证试验酒精浓度可达16.07%(V/V)。优化后酒精浓度提高了20%。     

钙离子通过降低细胞膜透性提高自絮凝颗粒酵母耐酒精能力

生长阶段和冲击阶段均添加 1 6 4mmol LCa2 能显著提高自絮凝颗粒酵母于 30℃在 2 0 % (V V)酒精冲击下的存活率 ,经过 9h冲击 ,对照组的存活率为 0 ,而添加Ca2 试验组的存活率为 5 0 0 % ,表明添加适当浓度的Ca2 能显著提高菌体的耐酒精能力。通过考察Ca2 对菌体于 30℃在 15 % (V V)酒精冲击下细胞膜透性的影响发现 ,生长阶段和冲击阶段均添加 1 6 4mmol LCa2 的试验组的菌体胞外核苷酸平衡浓度和细胞膜透性系数 (P′)分别仅为对照组水平的 5 0 0 %和 2 9 3% ,表明添加适当浓度的Ca2 能显著降低受冲击菌体的细胞膜透性 ;而且 ,添加Ca2 提高存活率与添加Ca2 降低胞外核苷酸浓度和P′存在直接的对应关系。因此 ,Ca2 提高自絮凝颗粒酵母耐酒精能力是与其降低受冲击菌体的细胞膜透性密切相关的。     

高产谷胱甘肽酿酒酵母的选育及发酵工艺的研究

以酿酒酵母SC-001为出发菌株,利用紫外诱变结合乙硫氨酸和氯化锌的底物选择筛选到1株有较高GSH产量的酿酒酵母菌株SC-001-24,其GSH产量为743 mg/L,比出发菌株提高了22%。进一步在10 L发酵罐中考察了不同发酵模式和前体氨基酸补加方式对酿酒酵母产GSH的影响,确定最佳发酵模式为补料分批发酵,最佳前体氨基酸补加策略为:初始培养基加入41 mmol/L半胱氨酸,发酵42 h后一次性补加半胱氨酸246 mmol,甘氨酸160 mmol,谷氨酸82 mmol。在最佳发酵条件下GSH产量达到1 280.4 mg/L。     

超高浓度培养基条件下酵母细胞生长及酒精生成的准稳态动力学研究

在1．5L搅拌式发酵罐中,使用葡萄糖质量浓度分别为120、200、280g／L的培养基进行酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae连续发酵生成酒精的动力学研究。研究发现,当培养基中葡萄糖浓度为200和280g／L时,发酵液中残糖浓度、酒精浓度以及菌体生物量从小幅度波动的准稳态发展到大幅度波动的振荡状态。提出了伴有周期性振荡现象准稳态过程的概念,并针对该过程,建立了兼有底物和产物抑制的酵母细胞生长和产物酒精生成动力学模型。     

外源脂肪酸对酒精诱导自絮凝颗粒酵母细胞膜磷脂脂肪酸组成变化的影响

实验将自絮凝颗粒酵母培养于同时添加脂肪酸 (0.6mmol/L)和酒精 (6 %～ 9% ,V/V)条件下以考察其细胞膜磷脂脂肪酸组成的变化。与单独添加棕榈酸相比 ,同时添加酒精引起细胞膜磷脂棕榈酸含量明显增加 ,伴随 9十四碳烯酸、棕榈油酸和油酸含量明显减少 ;与单独添加亚油酸相比 ,同时添加酒精未引起细胞膜磷脂亚油酸含量明显变化 ,但引起油酸含量明显增加 ,伴随 9 十四碳烯酸、棕榈油酸和棕榈酸含量减少 ;与单独添加亚麻酸相比 ,同时添加酒精引起细胞膜磷脂亚麻酸含量减少 ,伴随油酸含量显著增加 ,同时 9 十四碳烯酸、棕榈油酸和棕榈酸含量减少。存活率实验证实 ,上述变化是菌体对酒精刺激的适应性响应 ,因为 ,与培养于仅添加脂肪酸条件下的菌体相比 ,培养于同时添加酒精条件下的菌体耐酒精能力明显提高。研究表明 ,棕榈酸和油酸都可通过加强细胞膜渗透屏障而提高菌体的耐酒精能力 ,这是饱和脂肪酸 (SFA)与不饱和脂肪酸 (UFA)可提高同一菌株耐酒精能力的新的实验现象 ,揭示UFA与SFA在影响酵母菌耐酒精能力的机制上存在共同的作用方式     

Effects of particulate materials and osmoprotectants on very-high-gravity ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae.

The effects of osmoprotectants (such as glycine betaine and proline) and particulate materials on the fermentation of very high concentrations of glucose by the brewing strain Saccharomyces cerevisiae (uvarum) NCYC 1324 were studied. The yeast growing at 20 degrees C consumed only 15 g of the sugar per 100 ml from a minimal medium which initially contained 35% (wt/vol) glucose. Supplementing the medium with a mixture of glycine betaine, glycine, and proline increased the amount of sugar fermented to 30.5 g/100 ml. With such supplementation, the viability of the yeast cells was maintained above 80% throughout the fermentation, while it dropped to less than 12% in the unsupplemented controls. Among single additives, glycine was more effective than proline or glycine betaine. On incubating the cultures for 10 days, the viability decreased to only 55% with glycine, while it dropped to 36 and 27%, respectively, with glycine betaine and proline. It is suggested that glycine and proline, known to be poor nitrogen sources for growth, may serve directly or indirectly as osmoprotectants. Nutrients such as tryptone, yeast extract, and a mixture of purine and pyrimidine bases increased the sugar uptake and ethanol production but did not allow the population to maintain the high level of cell viability. While only 43% of the sugar was fermented in unsupplemented medium, the presence of particulate materials such as wheat bran, wheat mash insolubles, alumina, and soy flour increased sugar utilization to 68, 75, 81, and 82%, respectively.     

过表达长链鞘氨醇激酶基因LCB4提高酿酒酵母抑制物耐受性

木质纤维素预处理过程中产生的有毒副产物严重影响了纤维素乙醇发酵,提高酿酒酵母抑制物耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的有效方法。文中通过过表达LCB4基因,研究了重组菌株S288C-LCB4在乙酸、糠醛和香草醛胁迫下的细胞生长和乙醇发酵性能。结果表明,LCB4过表达菌株在分别含有10 g/L乙酸、1.5 g/L糠醛和1 g/L香草醛的平板中生长均优于对照菌株;在分别含有10 g/L乙酸、3 g/L糠醛和2 g/L香草醛的液体乙醇发酵过程中,重组菌株S288C-LCB4乙醇发酵产率分别为0.85 g/(L·h)、0.76 g/(L·h)和1.12 g/(L·h),比对照菌株提高了34.9%、85.4%和330.8%;且糠醛和香草醛胁迫下发酵时间分别缩短了30 h和44 h。根据发酵终点发酵液代谢物分析发现重组菌株比对照菌株产生了更多甘油、海藻糖和琥珀酸,这些物质有利于增强菌株的抑制物耐受性。综上所述,LCB4基因过表达可显著提高酿酒酵母S288C在乙酸、糠醛和香草醛胁迫下的乙醇发酵性能。     

Application of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis karyoductants to the production of ethanol from xylose

Karyoductants of Saccharomyces cerevisiae V30 and Pichia stipitis CCY 39501 with the ability to ferment D-xylose to ethanol were isolated. The ability of these isolates to assimilate different sugars, ethanol tolerance and ethanol production from D-xylose was investigated. Karyoductants didn't grow on starch, lactose and cellobiose, like S. cerevisiae, but showed good growth on xylose and L-arabinose, like P. stipitis. All isolates fermented xylose to ethanol slower than P. stipitis and with lower yields, 0.09 - 0.16 g/g. They secreted also about 3.4 - 7.1 g/dm3 of xylitol to the culture medium (P. stipitis only 0.06 g/dm3). The karyoductants showed an average tolerance to ethanol when compared with the parent strains and fermented glucose in the presence of 6% alcohol whereas parent strain S. cerevisiae and P. stipitis showed exogenic ethanol tolerance of 9% and 3%, respectively.     

絮凝特性对自絮凝颗粒酵母耐酒精能力的影响及作用机制

首次报道絮凝特性提高酵母菌耐酒精能力的现象及其机制。融合株SPSC与其两亲本粟酒裂殖酵母变异株和酿酒酵母变异株于 30℃经 18% (V/V)酒精冲击 7h的存活率分别为 52%、37%和 9%。细胞膜磷脂脂肪酸组成分析表明 ,两絮凝酵母 (融合株SPSC和粟酒裂殖酵母变异株 )的棕榈酸含量均约为非絮凝酵母 (酿酒酵母变异株 )的两倍 ,而棕榈油酸和油酸的含量明显低于后者。研究表明 ,当两絮凝酵母在培养中由于柠檬酸钠的作用 (抑制絮凝体的形成 )而以游离细胞生长存在时 ,其细胞膜磷脂棕榈酸含量显著下降 ,而棕榈油酸和油酸的含量明显增加 ,结果细胞膜磷脂脂肪酸组成特点与酿酒酵母变异株相似 ;而且实验表明 ,絮凝特性的消失伴随菌体耐酒精能力的急剧下降 ,变得与酿酒酵母变异株的水平相当。这些结果提示两絮凝酵母具有较强的耐酒精能力与其细胞膜磷脂脂肪酸组成中含有更高比例的棕榈酸有关。     

酿酒酵母产苹果酸的还原TCA路径构建及发酵调控

苹果酸广泛应用于食品、化工行业。文中通过在酿酒酵母内敲除丙酮酸脱羧酶PDC1,并通过构建胞质内还原TCA的路径,即超表达丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶,成功地实现了苹果酸的生产。在野生型菌株中基本检测不到苹果酸的生成,而在工程菌株,苹果酸发酵浓度达到了45 mmol /L,同时副产物乙醇的产量也降低了18%。进一步通过发酵调控提高第二信使Ca2+的浓度使苹果酸的产量提高了7 %,在此基础上提高丙酮酸羧化酶的辅酶生物素浓度,使苹果酸的产量达到52.5 mmol /L,较原始菌株提高了16%。     

硫酸锌添加对酿酒酵母乙酸胁迫条件下全局基因转录的影响

【目的】利用转录组测序研究硫酸锌添加提高絮凝酿酒酵母SPSC01乙酸胁迫耐性的分子机理。【方法】在10.0 g/L乙酸胁迫条件下,添加0.03 g/L硫酸锌,取对数期酿酒酵母细胞,与不添加硫酸锌的对照组细胞进行比较转录组分析。【结果】添加硫酸锌的实验组与对照组相比较,50个基因转录水平上调,162个基因转录水平下调,这些转录水平变化明显的基因涉及糖代谢、甲硫氨酸合成、维生素合成等多条代谢途径,此外,转录水平变化的基因还包括抗氧化酶基因等关键胁迫响应基因。【结论】硫酸锌添加可改变酿酒酵母全局基因转录水平,提高抗氧化酶及其他胁迫耐性相关基因的表达,影响细胞氧化还原平衡和能量代谢,通过对多基因转录的调控提高酿酒酵母乙酸耐受性。     

海藻糖与热激蛋白在酿酒酵母耐受乙醇胁迫中的作用

在燃料乙醇发酵生产过程中,酿酒酵母经常会受到高浓度乙醇的胁迫,导致乙醇转化率和产量降低。面对高浓度乙醇的胁迫,酿酒酵母也具有应对胁迫的应激机制。在对这种应激机制进行了解的基础上,如能提高酿酒酵母对乙醇的耐受性,对于燃料乙醇生产具有重要意义。在高浓度乙醇胁迫下,酿酒酵母细胞会产生一系列保护性物质,如海藻糖、热激蛋白、脯氨酸等,这些物质能够提高酿酒酵母细胞对乙醇的耐受性。海藻糖作为一种重要的碳源、能量贮藏物质,不仅能稳定细胞膜、蛋白质和核酸等大分子物质,还可增强酿酒酵母对高浓度乙醇的耐受性。此外,酿酒酵母还可以产生大量的热激蛋白,增强酿酒酵母的抗逆性。从海藻糖和热激蛋白在乙醇胁迫下对酿酒酵母细胞保护作用的研究方面进行了综述,并对存在的问题进行了讨论与展望。